維藥瘤果黑種草子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

王園姬， 陳 文， 駱從艷， 慕春海， 李超鵬

(新疆石河子大學(xué)藥學(xué)院教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子832000)

黑種草為毛茛科植物瘤果黑種草(Nigella glandulifera Freyn)的干燥成熟種子。秋季采收成熟果實(shí)，除去泥沙及果皮，曬干［1］。目前作為藥用的有3個(gè)種，分別為瘤果黑種草(Nigella glandulifera Freyn)，又名腺毛黑種草;果黑種草(Nigella sativa Linn)，又名家黑種草;以及黑種草(Nigella damascene L.)［2］。

瘤果黑種草子為新疆維吾爾族和西雙版納傣族習(xí)用藥材，別名斯亞旦。其功效為利尿、活血、解毒、通乳;還可烏發(fā)、延緩衰老［3］?；瘜W(xué)成分主要有黃酮、皂苷、脂肪酸、揮發(fā)油和生物堿等［4］。國外有文獻(xiàn)報(bào)道其生物活性主要為抗氧化、降血糖［5］、抗腫瘤等［6］。已有研究證實(shí)瘤果黑種草子中含有多種常春藤皂苷類化合物［7，8］，并有對其中總黃酮測定的研究［9］，但尚未見有關(guān)于常春藤皂苷元含量測定的報(bào)道。原藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)也僅有性狀鑒別。本實(shí)驗(yàn)建立了其薄層鑒別的方法，并進(jìn)一步建立了HPLC測定瘤果黑種草子中常春藤皂苷元含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確、快速、專屬性強(qiáng)，為瘤果黑種草子藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的修訂提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters 600型高效液相色譜儀，Waters2996檢測器;UV-2401型紫外可見光分光光度計(jì)(日本島津);Sartorius(BP211D)電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);超聲波提取器。

1.2 試藥 瘤果黑種草子對照藥材(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)121428-200501);常春藤皂苷元對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)820-20002);硅膠G(青島海洋化工有限公司)。水為自制超純水;乙腈為色譜純試劑，其他溶劑為分析純試劑。瘤果黑種草子(購自新疆烏魯木齊市二道橋藥材市場)，由新疆石河子大學(xué)藥學(xué)院成玉懷副教授鑒定為瘤果黑種草子(Nigella glandulifera Freyn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別 稱取常春藤皂苷元對照品適量，用甲醇溶解配制成0.16 mg/mL的溶液，作為對照品溶液。稱取瘤果黑種草子藥材粉末(過30目篩)與對照藥材各約0.5 g，分別加70%乙醇加熱回流提取1 h，常壓過濾。濾液分別作為供試品溶液和對照藥材溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，用毛細(xì)管分別吸取供試品溶液、對照藥材溶液及常春藤皂苷元對照品溶液適量，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以苯-甲醇-甲酸(17∶6∶1)為展開劑，展開、取出、晾干，噴以10%的硫酸-乙醇試液，105℃烘至斑點(diǎn)清晰。供試品色譜中，在與對照藥材及常春藤皂苷元對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯示清晰可見的紫色斑點(diǎn)。見圖1。

2.2 HPLC測定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用 色譜柱:Kromasil100-5C18(250 mm×4.6 mm，5μm)，流動(dòng)相:乙腈-0.05%磷酸水(68∶32);檢測波長:208 nm;柱溫:20℃;流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣體積:20μL。理論板數(shù)按常春藤皂苷元峰計(jì)不低于4 000。對照品及樣品色譜圖見圖2。

圖1 瘤果黑種草子TLC薄層圖

圖2 常春藤皂苷元(A)對照品和瘤果黑種草子藥材(B)HPLC圖譜

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取減壓干燥至恒重的常春藤皂苷元對照品適量，加甲醇制成0.21 mg/mL的溶液，即得。吸取此對照品溶液1 m L到10 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，得濃度為0.021 mg/mL的對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 稱取本品粗粉(過30目篩)約2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇50 mL，超聲提取30 min，濾過，殘?jiān)偌蛹状?0 mL，超聲提取30 min，甲醇適量清洗殘?jiān)?，合并濾液與洗液，減壓揮干溶劑。殘?jiān)?0 mL水溶解，水飽和正丁醇萃取3次，每次20 mL，合并萃取液，減壓揮干溶劑。殘?jiān)蛹状?0 mL，鹽酸4 mL，70℃加熱水解4 h。水解產(chǎn)物加水10 m L，氯仿萃取2次，每次20 mL，合并萃取液，減壓揮干溶劑。殘?jiān)眉状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至50 m L量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，過0.22μm的微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 線性關(guān)系考察 按上述色譜條件，精密吸取0.021 mg/mL對照品溶液3 mL于5 mL量瓶中，得濃度為12.6 μg/mL對照品溶液。分別精密吸取12.6μg/m L的對照品溶液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 mL 到5 mL 量瓶中，甲醇稀釋至刻度(濃度分別為 0.252、0.504、1.26、2.52、5.04、10.08 μg/mL)，分別精密吸取20μL，注入高效液相色譜儀，測定峰面積。以峰面積Y積分值為縱坐標(biāo)，常春藤皂苷元的濃度C(μg/mL)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，常春藤皂苷元的回歸方程為:Y=208 596×C－10 088(r=0.999 9)，表明常春藤皂苷元進(jìn)樣量在0.252～10.08μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取對照品溶液(濃度為5.04 μg/mL)20μL，按上述色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，常春藤皂苷元峰面積的RSD為0.24%(n=6)。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液在0、2、4、6、8、12 h后，依法測定，常春藤皂苷元峰面積的RSD為2.0%。表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取瘤果黑種草子藥材5份，每份約1.0 g，分別精密稱定，制備成供試品溶液，測定峰面積，常春藤皂苷元峰面積的RSD為1.3%(n=5)。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 稱取已知含量的瘤果黑種草子藥材9份，每份各約0.03 g，分別精密稱定，加入常春藤皂苷元對照品溶液(10.08 μg/mL)0.8 mL、1.0 mL、1.2 m L，制備成供試品溶液，進(jìn)樣測定峰面積，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.2.9 樣品含量測定 分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液20μL，注入液相色譜儀，測定5份藥材樣品。測定結(jié)果見表2。

表2 樣品測定結(jié)果(n=5)

3 討論

3.1 本實(shí)驗(yàn)建立的薄層色譜鑒別方法，分離度好，顯色后斑點(diǎn)顏色清晰。

3.2 瘤果黑種草子中的三萜皂苷以常春藤皂苷元為苷元。由于三萜皂苷極性較大，先用甲醇進(jìn)行超聲提取;根據(jù)皂苷在水飽和正丁醇中溶解性較好的性質(zhì)，再用水飽和正丁醇提取皂苷，然后加酸水解。由于三萜皂苷水解成常春藤皂苷元，極性變小，所以用極性小的有機(jī)溶劑氯仿提取常春藤皂苷元。在各步萃取過程中，注意兩相之間的靜置分層，尤其是第一步水飽和正丁醇萃取時(shí)，切勿劇烈振搖，避免乳化現(xiàn)象，使分層不明顯，影響含量測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3.3 常春藤皂苷元分子結(jié)構(gòu)中無共軛體系，屬于末端吸收，紫外吸收較弱。根據(jù)文獻(xiàn)采用高效液相-二極管陣列檢測器，確定檢測波長為208 nm。此波長下常春藤皂苷元的峰與其他峰分離良好，峰面積最大，故選擇208 nm作為檢測波長。

3.4 在含量測定過程中，考慮到常春藤皂苷元處于末端吸收，且甲醇本身就對其測定有干擾，故選擇乙腈-0.05%磷酸作為流動(dòng)相，進(jìn)行等度洗脫，常春藤皂苷元的峰能與其它相鄰峰達(dá)到很好的分離，且基線較平穩(wěn)，峰型好。

［1］中國藥典［S］.一部.2005:241.

［2］新疆植物志編輯委員會(huì).新疆植物志［M］.第2卷第2分冊，第1版.新疆:科技衛(wèi)生出版社，1995:35-36.

［3］倪君君，王喆星，吳立軍.瘤果黑種草子化學(xué)成分的研究［D］.沈陽，沈陽藥科大學(xué)，2007.

［4］劉玉明，楊峻山，劉慶華.瘤果黑種草子化學(xué)成分的研究［J］.中國中藥雜志.2005，30(13):980-982.

［5］Kanter M.Effects of Nigella sativa and its major constituent，Thymoquinone on sciatic nerves in experimental diabetic neuropathy［J］.Neurochem Res，2008，33:87-96.

［6］Khan M A.Chemical composition and medicinal properties of Nigella sativa Linn［J］.Inflammopharmacology，1999，7(1):15-35.

［7］倪君君，吳兆華，高慧媛，等.瘤果黑種草子的化學(xué)成分［J］.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，24(4):215-218.

［8］郝海峰，任麗娟，陳玉武.黑種草子化學(xué)成分研究［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，1996，31(9):689-694.

［9］艾尼娃兒·艾克木，美麗萬· 阿不都熱依木，王巖，等.維吾爾藥黑種草子中總黃酮含量的測定［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2008，19(5):1167-1168.