廣藿香多糖的優(yōu)化提取工藝及抗氧化作用

烏蘭格日樂， 白海泉， 翁 慧， 德力根

(1.內(nèi)蒙古民族大學化學化工學院，內(nèi)蒙古通遼028043;2.內(nèi)蒙古科右中旗高力板中學，內(nèi)蒙古興安盟029000)

廣藿香，又名刺蕊草、藿香(Pogostemon patchoul)。本品為唇形科植物廣藿香，氣味芳香，味微苦。功能與主治:化濁，開胃止嘔，化表解暑。用于濕濁中阻，脘痞嘔吐，暑濕倦怠，胸悶不舒，寒濕閉暑，腹痛吐瀉，鼻淵頭痛［1］。近年來研究表明，多糖具有清除活性氧、延緩機體衰老之功能。有關廣藿香多糖的提取及抗氧化性方面的研究作者未見相關報道。本文利用正交實驗對廣藿香多糖的提取進行了優(yōu)化選擇并用分光光度法測定了廣藿香多糖對活性氧的清除作用。

1 儀器與試劑，材料

1.1 儀器

NICOLET5700 FT—IR紅外光譜分析儀(美國惠普公司)、UV—240型分光光度計(日本島津)、透析袋(36DM，上海進口分裝)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE52CS(上海亞榮生化儀器廠)、PHS-3B型酸度計(上海雷磁儀器廠)、722型可見分光光度計(上海第三分析儀器廠)。

1.2 試劑與材料

苯酚、濃硫酸、鄰苯三酚、過氧化氫、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)、硫酸亞鐵銨、三羥甲基氨基甲烷(Tris，)等均為國產(chǎn)分析純。藩紅花紅T(生化試劑，sigma公司)，氯化硝基四氮唑蘭NBT(生化試劑，sigma公司)，對照品葡萄糖和甘露醇為分析純，購于上海汕頭光華化學試劑有限公司，廣藿香購于通遼市中草藥店。實驗用水為重蒸水。

2 方法

2.1 正交實驗設計

采用L9(33)正交表進行實驗設計，(見表1)選擇提取溫度，提取時間，醇析時間等三因素，每個因素選取3個水平，分析這些因素對提取水溶性多糖的影響。

表1 試驗因素水平表

2.2 水溶性多糖的提取、精制

根據(jù)表1的正交實驗設計要求，準確稱取風干粉碎為60目的廣藿香10.00 g，用重蒸水作溶劑，回流加熱、濾液濃縮，醇沉靜置、過濾洗滌、干燥，重蒸水復溶、脫色、saveg法除蛋白，透析除去一些低聚糖等小分子雜質(zhì)，濾液濃縮、洗滌、干燥、稱重，計算得率(見表2)。

2.3 水溶性多糖的含量測定

以葡萄糖為對照品，采用硫酸-苯酚法［2］測定多糖含量(見表2)。

2.4 多糖抗氧化性的測定

2.4.1 廣藿香多糖對·OH的清除作用 測定方法參考文獻方法［3］?！H 由 EDTA-Na2-Fe(Ⅱ)-H2O2體系產(chǎn)生，由于·OH可使藩紅花紅T褪色，根據(jù)褪色程度用比色法來衡量·OH的含量。實驗結(jié)果以清除率E%表示，EC50表示達到50%清除率體系中的藥物濃度。E%=(A1－A0)/A1×100%進行計算［4］，(A0表示空白液吸光度;A1表示試液吸光度)結(jié)果見表3。

表2 L 9(33)正交實驗設計及結(jié)果

表3 廣藿香多糖及甘露醇對·OH的清除作用(n=5)

2.4.2 廣藿香多糖對O－2·的清除作用 鄰苯三酚在堿性條件下易氧化產(chǎn)生超氧自由基(O－2·)，O－2·與NBT作用形成紫色化合物在530 nm處有吸收，以A值反映O－2·的含量。加入不同濃度試液，測定樣品對A值的影響。測定方法參考文獻方法［3］。測定結(jié)果以清除率E%=(A0－A1)/A0×100%計算［4］，(A0表示空白液吸光度;A1表示試液吸光度)結(jié)果見表4。

表4 廣藿香多糖及甘露醇對O－2·的清除作用(n=5)

2.5 統(tǒng)計分析

用SPSS17軟件完成。正交試驗部分進行方差分析，藥效學部分數(shù)據(jù)用±s表示，組間差異進行方差分析及t檢驗。

3 結(jié)果與討論

3.1 正交試驗方差和極差分析結(jié)果

通過多糖得率和含量兩個指標綜合分析影響因素提取溫度A、提取時間B、醇析時間C對多糖得率和含量影響上無顯著性差異(P>0.05)，所以在提取多糖時須同時考慮三個因素的影響。同時通過極差r(R)的大小直觀分析各因素對指標影響的程度［5］:對廣藿香多糖得率而言，因素B影響作用最大(其P值接近0.05)，因素C次之，因素A影響較小;而對廣藿香多糖含量而言，因素C影響作用最大(其P值也最小)，因素A次之，因素B影響較小。根據(jù)正交試驗結(jié)果，選取各影響因素的最優(yōu)水平組合為A2B2C2。即廣藿香多糖的最佳提取條件為:提取溫度70℃，提取時間為3 h，醇析時間為30 h。

3.2 驗證試驗

按照上述研究結(jié)果所確定的最佳提取條件，提取廣藿香多糖3批，并分別考察廣藿香多糖的得率和含量。通過3次驗證試驗可以看出得率和含量的誤差小，說明該工藝科學、合理、穩(wěn)定性好。見表5。

表5 驗證試驗結(jié)果

3.3 廣藿香多糖的光譜分析

廣藿香多糖的紫外吸收光譜在260 nm和280 nm處未見吸收峰，表明精制后的廣藿香多糖中不含氨基酸和蛋白質(zhì)。其紅外光譜890.57 cm－1處有吸收峰，表明廣藿香多糖的分子結(jié)構(gòu)中存在β-糖苷鍵。

3.4 廣藿香多糖對氧自由基的清除能力

從表3可以看出廣藿香多糖對·OH的平均清除能力大于對照品甘露醇，且同濃度的清除能力與甘露醇比較具有極顯著性差異(P<0.01)。從表4可以看出廣藿香多糖對O－2·有很強的清除作用，不僅清除能力均大于甘露醇。且清除能力與甘露醇比較具有極顯著性差異(P<0.01)。其清除能力強的原因有可能與分子中存在β-糖苷鍵有關［6］。本實驗結(jié)果顯示廣藿香多糖對·OH和O－2·有很強的清除作用，而且隨濃度增大，效果增強。表明廣藿香多糖是良好的氧自由基清除劑，可作為其在防衰老、抗炎癥、降血脂、抗腫瘤、增強免疫等功效的藥理基礎。

［1］張 英，張金超，陳 瑤，等.廣藿香生藥、化學及藥理學的研究進展［J］.中草藥，2006，37(5):586-590.

［2］劉曉河，梁惠花，譚曉紅，等.茵陳中多糖的含量測定［J］.中草藥，2003，34(6):519-520.

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［5］張 玉，戴立泉，王凱平.正交試驗優(yōu)化當歸多糖鐵的合成條件研究［J］.中成藥，2007，29(4):581-583.

［6］李 平，王艷輝，馬潤宇.山茱萸多糖PFCA III的理化性質(zhì)及生物活性研究［J］.中國藥學雜志 ，2003，38(8):583-586.