重組微小毛霉凝乳酶的發(fā)酵條件及其酶學(xué)性質(zhì)

李玉秋，王景會，李鐵柱，張 莉，楊貞耐*

重組微小毛霉凝乳酶的發(fā)酵條件及其酶學(xué)性質(zhì)

李玉秋，王景會，李鐵柱，張 莉，楊貞耐*

(吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究中心，吉林 長春 130033)

通過對重組微小毛霉凝乳酶(recombinant Mucor pusillus rennet，RMPR)發(fā)酵條件的研究，確定甲醇誘導(dǎo)體積分?jǐn)?shù)1%、初始OD600nm0.5、裝瓶量100mL/500mL搖瓶、誘導(dǎo)時(shí)間96h為發(fā)酵最適條件。培養(yǎng)液離心取上清用硫酸銨分級沉淀獲得粗酶液，并對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，經(jīng)測定該酶的最適反應(yīng)溫度為60℃，30～45℃酶較穩(wěn)定，保溫90min，剩余凝乳酶活力達(dá)86.5%；酶在pH5.5～7.0范圍內(nèi)，隨pH值升高，凝乳酶活力逐漸降低，pH5.5時(shí)凝乳酶活力最高。當(dāng)Ca2+濃度為0.03mol/L時(shí)凝乳酶活力最高，Na+濃度對凝乳酶活力沒有明顯影響，Ni2+和Fe2+對酶有抑制作用，Mn2+、K+、Mg2+對酶有一定的促進(jìn)作用。

微小毛霉；凝乳酶；酶學(xué)性質(zhì)；發(fā)酵；重組

小牛皺胃酶(calf rennet)主要用于干酪等制品的生產(chǎn)，但世界市場需求量日益增長，每年宰殺4000萬頭犢牛，仍不能滿足需要[1-2]。目前各國都在不斷尋找替代品，植物蛋白酶、其他動(dòng)物蛋白酶和微生物蛋白酶，雖然起到凝乳作用，但各有弊端，動(dòng)物源凝乳酶所制干酪風(fēng)味差、品質(zhì)低；植物蛋白酶和微生物蛋白酶表現(xiàn)出專一性不強(qiáng)、凝乳活性與分解活性比值低、對熱穩(wěn)定、在乳中殘留量高等問題，常常引起加工的干酪產(chǎn)量降低，成熟后出現(xiàn)苦味或其他不良風(fēng)味[3]。利用基因工程技術(shù)，將凝乳酶原的基因克隆并在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中表達(dá)，并可以按照人們的意愿改造凝乳酶，使其具有牛凝乳酶的優(yōu)良特性，從而拓寬了凝乳劑的來源，解決凝乳劑不足的現(xiàn)象[4-6]。

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是近年來發(fā)展很快的一個(gè)真核表達(dá)系統(tǒng)，它既具有原核表達(dá)系統(tǒng)操作簡單、易于培養(yǎng)、生長速度快、表達(dá)量高、成本低等優(yōu)點(diǎn)，還具有真核生物表達(dá)系統(tǒng)的對外源蛋白的翻譯后修飾等特點(diǎn)，如糖基化、蛋白磷酸化等[7]。此研究利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)微小毛霉凝乳酶，對其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，并從溫度、pH值、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、金屬離子濃度對酶活力的影響對其進(jìn)行研究，為工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)重組微小毛霉凝乳酶提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂乳奶粉、新西蘭進(jìn)口脫脂乳粉 金財(cái)公司分裝。

酵母提取物、蛋白胨、葡萄糖、甘油、生物素、甲醇 北京化工廠；酵母氮源(YNB) 美國BD公司。

1.2 菌種與培養(yǎng)基

畢赤酵母工程菌GS115/pPICZαA-MPR由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存。

種子培養(yǎng)基(YPD，g/100mL)：酵母提取物1、蛋白胨2、葡萄糖2[8]；發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基(BMGY)：酵母提取物1g/100mL、蛋白胨2g/100mL、YNB 1.34g/100mL、生物素0.5g/100mL、甘油體積分?jǐn)?shù)1%、0.1mol/L磷酸鉀(pH6.0)[7]；發(fā)酵誘導(dǎo)培養(yǎng)基(BMMY)：酵母提取物1g/100mL、蛋白胨2g/100mL、YNB 1.34g/100mL、生物素0.5g/100mL、甲醇體積分?jǐn)?shù)0.5%、0.1mol/L磷酸鉀(pH6.0)。

1.3 方法

1.3.1 重組菌的培養(yǎng)

挑取單菌落加入100mL YPD培養(yǎng)基中30℃、240r/min培養(yǎng)16h，獲得種子培養(yǎng)液，1:100(V/V)轉(zhuǎn)接入BMGY中，30℃、240r/min培養(yǎng)至OD600nm值達(dá)2～6之間，按不同接種量、不同裝瓶量接入BMMY，以不同甲醇體積分?jǐn)?shù)開始誘導(dǎo)，每24h補(bǔ)加甲醇1次，并每隔24h取樣1次，測定酶活性[9]。

1.3.2 粗酶液的制備

取1000mL誘導(dǎo)表達(dá)的酵母培養(yǎng)液離心后取上清，先加入硫酸銨164g，4℃攪拌沉淀過夜(16h)，4℃、8000 r/min離心10min，取上清液再加入硫酸銨181g，4℃攪拌沉淀過夜(16h)，4℃、8000r/min離心10min，沉淀溶于0.05mol/L磷酸鈉緩沖液中，即粗酶液。

1.3.3 凝乳酶活力測定

根據(jù)改進(jìn)的Magda等[10]方法，將脫脂乳用0.01mol/L CaCl2配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的復(fù)原脫脂乳溶液。35℃條件下，取待測酶液0.2mL加入2mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的復(fù)原脫脂乳中，充分混勻，開始計(jì)時(shí)，至絮狀凝集顆粒出現(xiàn)為止。在35℃、40min，凝固1mL 10%脫脂奶粉的酶量為一個(gè)酶活力單位。

式中：D為酶液稀釋倍數(shù)；t為凝乳時(shí)間/s；2400為時(shí)間2400s即40min。

式中：A為所測的凝乳酶比活力/(U/mL)；A0為對照的凝乳酶比活力/(U/mL)。

1.3.4 酶學(xué)性質(zhì)測定方法

1.3.4.1 凝乳酶的最適溫度和熱穩(wěn)定性

分別取復(fù)原脫脂乳2mL，加入0.2mL待測酶液，分別在30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80℃條件下測定凝乳酶活力，脫脂乳和酶液預(yù)先在相應(yīng)的溫度下保溫2min，然后測定凝乳酶活力，以最大凝乳酶活力為100%作為對照，確定凝乳酶的最適反應(yīng)溫度。

將待測酶液分別在30、35、40、45、50、55、60、65℃條件下保溫10、20、30、40、50、60、90、120min后，吸取0.2mL加入2mL 35℃預(yù)熱的復(fù)原脫脂乳中，測定凝乳酶活力。以未處理前測得的凝乳活力為100%作為對照，測定凝乳酶的熱穩(wěn)定性。

1.3.4.2 凝乳酶的最適pH值及不同pH值下的穩(wěn)定性

分別取復(fù)原脫脂乳10mL裝入三角瓶中，用0.1mol/L HCl溶液和0.1mol/L NaOH溶液分別調(diào)pH值至5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0[11]。取2mL上述脫脂乳，加入0.2mL待測酶液在35℃條件下測定凝乳酶活力[10]，以最高凝乳活力為100%作為對照，測定凝乳酶反應(yīng)的最適pH值。

分別取10mL待測酶液，用檸檬酸鈉緩沖液調(diào)pH值至3.0、4.0，用磷酸緩沖液調(diào)pH值至6.0、7.0，用Tris-HCl緩沖液調(diào)pH值至8.0、9.0、10.0[12]。室溫放置20h后，用HCl溶液和NaOH溶液將pH值調(diào)至6.0，35℃條件下測定凝乳酶剩余酶活力，以未經(jīng)處理酶液測得的酶活力為100%作為對照，確定凝乳酶在不同pH值下的穩(wěn)定性。

1.3.4.3 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對凝乳酶活力的影響

分別取待測酶液加入到質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%、10%、12%、15%、20%的復(fù)原脫脂乳中，35℃條件下測定凝乳酶活力，以最高凝乳酶活力為100%作為對照。

1.3.4.4 鈣離子和鈉離子濃度對凝乳酶活力的影響

分別用不同濃度的CaCl2(5～500mmol/L)配制10%復(fù)原脫脂乳[13]，取2mL加入0.2mL待測酶液，35℃條件下測定凝乳酶活力，以未添加Ca+離子的脫脂乳測得的酶活力為100%作為對照。分別用不同濃度的NaCl溶液(10～300mmol/L )配制10%復(fù)原脫脂乳[13]，取2mL加入0.2mL待測酶液，35℃條件下測定凝乳酶活力，以未添加Na+離子的脫脂乳測得的酶活力為100%作為對照。

1.3.4.5 其他金屬離子對凝乳酶活力的影響

將復(fù)原脫脂乳配制成含各種金屬離子(Ni2+、Mn2+、Cu2+、K+、Fe3+、Fe2+、Mg2+)濃度為5mmol/L；在35℃條件下測定酶的相對凝乳酶活力，以未添加金屬離子的脫脂乳測得的酶活力為100%作為對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組菌發(fā)酵條件優(yōu)化

2.1.1 初始光密度值對產(chǎn)凝乳酶活力的影響

將種子液接于BMMY(pH6.0)中，OD600nm分別為0.5112、1.073、1.538、2.037、2.568，裝瓶量為100mL/500mL搖瓶，30℃、240r/min，甲醇誘導(dǎo)體積分?jǐn)?shù)為1%，每24h補(bǔ)加1次并取樣測定凝乳酶比活力，72、96、120h分別取樣測定凝乳酶比活力，結(jié)果見圖1。

圖1 初始光密度值對凝乳酶活力的影響Fig.1 Effect of initial OD600nmvalue on rennet activity

如圖1所示，起始OD600nm為0.5時(shí)，誘導(dǎo)72h后RMPR即可達(dá)到較高的凝乳酶比活力，誘導(dǎo)120h凝乳酶比活力達(dá)最大。起始OD600nm為1.0、1.5、2.0、2.5時(shí)誘導(dǎo)72h，RMPR活力較低，當(dāng)誘導(dǎo)120h后凝乳酶比活力最佳，但仍顯著低于起始OD600nm為0.5、誘導(dǎo)120h的RMPR達(dá)到的凝乳酶比活力，可見重組菌OD600nm為0.5時(shí)為最佳起始光密度值。

2.1.2 裝瓶量對凝乳酶活力的影響

將種子液接入BMMY中，OD600nm為1.085，500mL搖瓶裝量分別為50、100、200、300mL，30℃、240 r/min培養(yǎng)144h，甲醇體積分?jǐn)?shù)為1%，每24h補(bǔ)加一次并取樣測定凝乳酶比活力，連續(xù)培養(yǎng)144h，每隔24h取樣并測定凝乳酶比活力，結(jié)果見圖2。

圖2 裝瓶量對凝乳酶活力的影響Fig.2 Effect of volume of medium contained in 500 mL flask on rennet activity

如圖2所示，裝瓶量為100mL效果最佳，誘導(dǎo)144h后凝乳活力最高。50mL裝瓶量誘導(dǎo)144h，每隔24h取樣一次，均沒有檢測到凝乳活力，可能由于裝瓶量低，菌體溶氧量過高，菌株生長過于旺盛，分泌其他水解蛋白酶類，降解其表達(dá)的外源蛋白，致使外源蛋白水解不表現(xiàn)活性。裝瓶量為100、200、300mL時(shí)，誘導(dǎo)24h酶比活力大致相同；隨誘導(dǎo)時(shí)間增加，裝瓶量200mL和300mL發(fā)酵重組酶活力明顯低于100mL裝瓶量RMPR的比活力。裝瓶量過高，致使酵母溶氧量過低，菌體生長速度較慢，菌體狀態(tài)不佳，影響重組蛋白表達(dá)。

2.1.3 甲醇體積分?jǐn)?shù)對凝乳酶活力的影響

將種子液接入BMMY中，OD600nm為1.102，裝瓶量為100mL/500mL搖瓶，30℃、240r/min，甲醇體積分?jǐn)?shù)分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%，每24h補(bǔ)加1次，誘導(dǎo)144h，每隔24h取樣測定凝乳酶比活力。

圖3 甲醇體積分?jǐn)?shù)對凝乳酶活力的影響Fig.3 Effect of methanol concentration on rennet activity

如圖3所示，當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)為1%時(shí)，重組凝乳酶比活力最佳，明顯高于其他甲醇體積分?jǐn)?shù)誘導(dǎo)的凝乳酶比活力。當(dāng)用1.5%的甲醇時(shí)，重組凝乳酶活力稍低，但明顯高于0.5%和2.0%的甲醇時(shí)的凝乳酶比活力。當(dāng)用2.0%甲醇時(shí)對凝乳酶比活力有較大的影響，誘導(dǎo)72h以后重組凝乳酶比活力逐漸降低，可見甲醇體積分?jǐn)?shù)過高影響酵母的生長狀態(tài)，對酵母產(chǎn)生一定毒害的作用，抑制酵母生長，所以甲醇體積分?jǐn)?shù)不易過高。

2.1.4 最佳誘導(dǎo)時(shí)間的確定

圖4 產(chǎn)酶最佳誘導(dǎo)時(shí)間對凝乳酶活力的影響Fig.4 Effect of incubation time on rennet activity

將種子液接種于BMMY(pH6.0)中，OD600nm為1.102，裝瓶量為100mL/500mL搖瓶，甲醇體積分?jǐn)?shù)1.0%，每24h補(bǔ)加1次，每隔24h取樣測定凝乳酶比活力，連續(xù)誘導(dǎo)168h，結(jié)果見圖4。

如圖4所示，重組凝乳酶比活力隨誘導(dǎo)時(shí)間的增加酶比活力不斷增大，光密度值也隨之不斷的增大，96h后趨于平穩(wěn)，光密度值不再變化，凝乳酶比活力仍不斷增大，但增大幅度較小，所以從經(jīng)濟(jì)價(jià)值角度考慮，用時(shí)短，用料省，產(chǎn)酶活力較高為宜，確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間為96h。

2.2 酶學(xué)性質(zhì)

2.2.1 凝乳酶的最適溫度

圖5 溫度對凝乳酶活力的影響Fig.5 Effect of incubation temperature on rennet activity

如圖5所示，凝乳酶的最適反應(yīng)溫度為60℃；凝乳酶在35～60℃之間，凝乳酶活力隨溫度的升高而增大；當(dāng)溫度高于70℃時(shí)，酶活力明顯下降，到85℃時(shí)酶失活。與Megada[10]、Kumar[14]等報(bào)道的Bacillus sphaericus和Rhizopus oryzae凝乳酶的最適溫度55℃和60℃相近。

2.2.2 凝乳酶的熱穩(wěn)定性

圖6 凝乳酶的熱穩(wěn)定性Fig.6 Thermal stability of RMPR

如圖6所示，凝乳酶在30～45℃之間有較好的穩(wěn)定性，此溫度區(qū)間保持90min后，相對凝乳酶活力仍在80%以上。但隨著溫度的升高，溫度達(dá)到55℃保持20min，凝乳酶活力明顯降低，相對凝乳酶酶活力僅為36.5%，65℃、20min后凝乳酶活力完全喪失。韋薇等[1]報(bào)道的小牛凝乳酶55℃保溫90min相對酶活力為36.7%，60℃、60min完全失活。Megada[10]和Kumar[14]等報(bào)道的Bacillus sphaericus和Rhizopus oryzae凝乳酶60℃保溫20min，相對酶活力仍為30%和48%。說明RMPR與牛凝乳酶的熱穩(wěn)定性相當(dāng)，具有較高的熱不穩(wěn)定性。

2.2.3 凝乳酶反應(yīng)最適pH值的確定

圖7 pH值對凝乳酶活力的影響Fig.7 Effect of pH on RMPR activity

如圖7所示，pH值小于7.0時(shí)，凝乳酶活力隨pH值降低而增大，pH5.5時(shí)達(dá)到最大，pH值大于7.0時(shí)酶活力明顯減低，并逐漸失去酶活，與大多數(shù)凝乳酶pH值在5.0～7.0之間，隨pH值升高酶活力逐漸降低有所不同。但與Raposo等[13]報(bào)道的Centaurea calcitrapa細(xì)胞懸液中提取的凝乳酶最適pH值為5.1，pH值低于5.1時(shí)，凝乳酶活力有所降低的趨勢相一致。

2.2.4 凝乳酶在不同pH值下的穩(wěn)定性

圖8 凝乳酶在不同pH值下的穩(wěn)定性Fig.8 pH stability of RMPR

如圖8所示，凝乳酶在pH5.0～8.0之間相對較穩(wěn)定，pH6.0時(shí)酶活力最穩(wěn)定，長時(shí)間放置后活力沒有任何損失；該酶在pH值小于4的情況下很不穩(wěn)定，幾乎失去凝乳活力。Kumar等[14]報(bào)道的Rhizopus oryzae凝乳酶在pH5.5～7.5之間較穩(wěn)定，pH7.5凝乳酶剩余活力仍達(dá)96%。

2.2.5 底物(復(fù)原脫脂乳)質(zhì)量分?jǐn)?shù)對凝乳酶活力的影響如圖9所示，脫脂乳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%時(shí)凝乳酶活力最高，隨質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高凝乳酶活力逐漸降低，當(dāng)復(fù)原脫脂乳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%時(shí)，凝乳酶的相對活力僅為36.5%。Megada[10]、Kumar[14]等曾報(bào)道Bacillus sphaericus和Rhizopus oryzae凝乳酶在底物(復(fù)原脫脂乳)為8%和9%時(shí)，酶活力最高，底物(復(fù)原脫脂乳)質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸升高凝乳活力略有降低。

表1 金屬離子對凝乳酶活力的影響Table 1 Effects of other metal ions on RMPR activity

圖9 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對凝乳酶活力的影響Fig.9 Effect of substrate concentration on RMPR activity

2.2.6 不同CaCl2對凝乳酶活力的影響

圖10 鈣離子濃度對凝乳酶活力的影響Fig.10 Effect of Ca2+concentration on RMPR activity

如圖10所示，酶的凝乳活力隨Ca2+濃度增加而增大，當(dāng)達(dá)到30mmol/L時(shí)為最佳濃度，鈣促酶反應(yīng)達(dá)最高值，這一結(jié)果與Megada等[10]報(bào)道的Bacillus sphaericus凝乳酶最適Ca2+濃度25mmol/L相一致；隨著Ca2+濃度不斷增加凝乳酶活力逐漸降低，但仍然對凝乳酶反應(yīng)有促進(jìn)作用，只是促進(jìn)作用有所降低，Ca2+濃度達(dá)到300mmol/L時(shí)凝乳酶的相對活力仍為355%(數(shù)據(jù)未列出)。當(dāng)Ca2+濃度達(dá)到500mmol/L時(shí)，凝乳酶相對活力為94.5%，表明過高的Ca2+濃度對凝乳酶有一定的抑制作用。說明Ca2+濃度對凝乳酶有顯著的促進(jìn)作用。

2.2.7 不同NaCl濃度對酶活力的影響

圖11 NaCl濃度對凝乳酶活力的影響Fig.11 Effect of Na+concentration on RMPR activity

如圖11所示，NaCl在10～300mmol/L范圍內(nèi)對凝乳酶活力沒有明顯影響，同時(shí)都有一定的促進(jìn)作用。

2.2.8 其他金屬離子對凝乳酶活力的影響

金屬離子是酶反應(yīng)過程中重要的因子，一些金屬離子對酶反應(yīng)起到促進(jìn)作用，一些金屬離子對凝乳酶有抑制作用。從表1可以看出，Ni2+對凝乳酶有較強(qiáng)的抑制作用，F(xiàn)e3+、Fe2+對凝乳酶的抑制力較弱，Mn2+、Mg2+等離子對該凝乳酶起促進(jìn)作用，Cu2+對凝乳酶活力沒有影響。

3 結(jié) 論

畢赤酵母作為生產(chǎn)外源蛋白的優(yōu)良宿主已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用，目前已有400多種蛋白在此體系中得到成功表達(dá)，其中包括抗原、抗體、酶、膜蛋白和調(diào)節(jié)蛋白等。不同蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)水平有很大區(qū)別，同一蛋白在不同發(fā)酵條件下的表達(dá)水平也有顯著差異。常規(guī)發(fā)酵條件是滿足一般重組蛋白發(fā)酵所需的最基本條件，對表達(dá)某個(gè)具體的重組蛋白而言不一定是最佳條件，需要作適當(dāng)調(diào)整以最大限度地提高重組蛋白的表達(dá)量[15]。本實(shí)驗(yàn)重組微小毛霉凝乳酶在畢赤酵母中表達(dá)的最佳時(shí)間為96h，最佳裝瓶量為100mL/500mL搖瓶，甲醇誘導(dǎo)體積分?jǐn)?shù)為0.5%，初始光密度值為0.5時(shí)為宜。

微小毛霉凝乳酶是酸性蛋白酶，屬天冬氨酸蛋白酶家族，可特異切開κ-酪蛋白Phe105-Met106肽鍵，而具有較高凝乳活性，被廣泛用于乳酪制造業(yè)。不同來源的凝乳酶對溫度和pH值穩(wěn)定性不同，其中以微生物來源的凝乳酶最不敏感，穩(wěn)定性強(qiáng)。徐速[16]研究表明，凝乳酶的活性在25～70℃之間隨溫度的上升而升高，60℃處理10min酶活損失68%，pH值在2～7之間保持穩(wěn)定；韋薇等[1]報(bào)道的小牛凝乳酶的最適溫度為50℃，60℃保溫10min酶活損失96%；本實(shí)驗(yàn)中RMPR的最適溫度為60℃，60℃保溫10min酶活力損失72%，說明PMPR性質(zhì)與小牛凝乳酶性質(zhì)相近，可以作為牛凝乳酶的替代品，應(yīng)用于干酪生產(chǎn)中。

[1]韋薇, 韓剛, 徐鳳彩. 小牛凝乳酶的分離及部分特性研究[J]. 中國乳品工業(yè), 1997, 25(4): 21-24.

[2]周俊清, 林親錄, 趙謀明. 微生物源凝乳酶的研究進(jìn)展[J]. 中國食品添加劑, 2004(2): 6-9.

[3]CHITPINTYOL S, CRABBE M J C. Chymosin and aspartic proteinase [J]. Food Chemistry, 1998, 61(4): 395-418.

[4]楊寶進(jìn), 羅軍. 重組凝乳酶的研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2005, 21 (2): 186-189.

[5]張建忠, 徐筆峰, 胡斌斌. 基因工程凝乳酶的研究開發(fā)[J]. 食品研究與開發(fā), 1998, 19(3): 43-45.

[6]姜峰, 張?zhí)m威. 我國凝乳酶特性及其替代品的研究現(xiàn)狀[J]. 食品研究與開發(fā), 2003, 24(6): 3-6.

[7]丁月娣, 劉天會, 陳蘊(yùn), 等. 人腦鈉肽融合蛋白(HAS-(BNP)2)在畢赤酵母中的發(fā)酵條件及純化研究[J]. 藥物生物技術(shù), 2009, 16(2): 113-117. [8]楊國武, 袁保紅, 何國平, 等. 人DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ在畢赤酵母中的表達(dá)及發(fā)酵條件優(yōu)化[J]. 生物工程學(xué)報(bào), 2004, 20(2): 181-186.

[9]灑榮波, 石貴陽, 王正祥. 基因工程菌Pichia pastoris高密度培養(yǎng)條件的搖瓶研究[J]. 食品研究與開發(fā), 2005, 26(2): 52-57.

[10]MAGADA A, BENDARY E L, MAYSA E M, et al. Purification and characterization of milk clotting enzyme produced by Bacillus sphaericus [J]. Journal of Applied Sciences Research, 2007, 3(8):695-699.

[11]蘇光宇. 影響凝乳酶活性的研究[J]. 內(nèi)蒙古科學(xué)與經(jīng)濟(jì), 2006(11): 120-121.

[12]CHAZARRA S, SIDRCH L, LOPEZ-MOLINA D, et al. Characterization of the milk-clotting properties of extracts from artichoke (Cynara scolymus L.) flowers[J]. International Dairy Journal, 2007, 17(12): 1393-1400.

[13]RAPOSO S, DOMINGOS A. Purification and characterization milkclotting aspartic proteinases from Centaurea calcitrapa cell suspension cultures[J]. Process Biochemistry, 2008, 43(2): 139-144.

[14]KUMAR S, SHARMA N S, SAHARAN M R, et al. Extracellular acid protease from Rhizopus oryzae: purification and characterization[J]. Process Biochemistry, 2005, 40(5): 1701-1705.

[15]楊金玲, 黃鎮(zhèn)太, 朱平, 等. 重組人凝集素樣氧化型低密度脂蛋白受體-1在畢赤酵母中表達(dá)條件的優(yōu)化[J]. 藥物生物技術(shù), 2007, 14(3): 178-181.

[16]徐速. 影響微小毛霉凝乳酶活力的因素[J]. 生物技術(shù), 1996, 6(4): 28-30.

Fermentation Conditions for the Production of Recombinant Mucor pusillus Rennet and Its Enzymological Characterization

LI Yu-qiu，WANG Jing-hui，LI Tie-zhu，ZHANG Li，YANG Zhen-nai*
(Center of Agro-Food Technology, Jilin Academy of Agricultural Sciences, Changchun 130033, China)

The aims of this study were to investigate the fermentation conditions for the production of recombinant Mucor pusillus rennet (RMPR) and to enzymologically characterize the enzyme obtained. An optimum enzyme activity was obtained after 96 h of induction with 1% methanol as the inducer under the following conditions: initial OD600 nm, 0.5; and volume of medium contained in 500 mL flask, 100 mL．The incubation both obtained was centrifugated, and the supernatant was then salted out with ammonium sulfate to prepare crude enzyme solution, and enzymological characterization was carried out for the crude enzyme solution. The optimal reaction temperature of the enzyme was 60 ℃, and it kept stable in the temperature range from 30 to 45 ℃ and the residual enzyme activity was still 86.5% after 90 min of incubation at 45 ℃. As pH increased from 5.5 to 7.0, the activity of the enzyme presented a gradual decrease and the highest enzyme activity was observed at pH 5.5. At a Ca2+concentration of 0.03 mol/L, the enzyme had the highest activity to clot milk, and Na+had no notable effect on the enzyme, and Ni+and Fe2+were both an enzyme inhibitor, while Mn2+, K+and Mg2+all had promoting effect on the enzyme.

Mucor pusillus；rennet；enzymological characterization；fermentation；recombinant

Q814.3

A

1002-6630(2010)19-0225-06

2010-01-09

國家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2006AA10Z306)；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(nycytx-0502)

李玉秋(1979—)，女，研究實(shí)習(xí)員，碩士，研究方向?yàn)槿槠飞锛夹g(shù)。E-mail：lyqhb1@126.com

*通信作者：楊貞耐(1965—)，男，研究員，博士，研究方向?yàn)槿槠飞锛夹g(shù)與乳品工藝。E-mail：zyang@cjaas.com