激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)紫花地丁水浸出物對(duì)HBV的影響

王 玉，吳中明，羅 果，王美麗

（遵義醫(yī)學(xué)院，貴州 遵義563003）

紫花地丁(Viola Yedoensis Makino)屬堇菜屬,傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為紫花地丁味苦、性寒,具有清熱解毒,抗菌消炎的功效。臨床上，紫花地丁及含有紫花地丁的方劑主要用于治療各種病原體感染,特別是慢性感染和自身免疫性疾病[1]。激光共聚焦顯微鏡(laser confocal scanning microscopy,LSCM)是一種新型高精度的激光源加共聚焦顯微鏡,可對(duì)活的或固定的細(xì)胞及組織標(biāo)本的熒光定量分析,離子含量的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)分析檢測(cè)等。本實(shí)驗(yàn)利用LSCM與間接免疫熒光結(jié)合，觀察紫花地丁對(duì)乙型肝炎病毒 (Hepatitis B virus,HBV)DNA全基因轉(zhuǎn)染的HepG2.2.15細(xì)胞[2，3]內(nèi)的HBsAg、HBeAg和HBcAg的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 HepG2.2.15細(xì)胞株，購于解放軍302醫(yī)院傳染病研究所病毒所。

1.2 主要儀器 激光共聚焦顯微鏡（Leica TCS SP2）。

1.3 主要試劑 ①M(fèi)TT（華美生物工程公司）；②羊抗人-IgG-FITC（華美生物工程公司）；③抗-HBs、抗-HBe和抗-HBc免疫血清（華美生物工程公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)藥物 ①紫花地丁水提取物儲(chǔ)存液：稱取100 g紫花地丁，切碎后加適量超純水浸沒紫花地丁，置于4℃冰箱浸泡過夜。次日加熱煮沸，保持微沸浸出一定時(shí)間，重復(fù)煎煮3次，分離并收集各次煎出液，濃縮至250 mL溶液，濃度相當(dāng)于每mL含400mg生藥量，過濾除菌分裝，置-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。②使用DMEM完全培養(yǎng)液配制各實(shí)驗(yàn)濃度藥物。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 細(xì)胞培養(yǎng) HepG2.2.15細(xì)胞用含10%嬰牛血清、380mg/L G418（實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)液不加）、100U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素、用0.238%HEPS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，每4～5天換1次培養(yǎng)液，約7d傳代1次。HepG2.2.15細(xì)胞為貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞，傳代時(shí)用0.25%胰酶消化。

1.5.2 MTT法測(cè)細(xì)胞毒性 ①接種細(xì)胞：將生長(zhǎng)良好的HepG2.2.15細(xì)胞以5×104個(gè)/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板，置于37℃、5﹪CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。②藥物作用：HepG2.2.15細(xì)胞貼壁后經(jīng)血清饑餓法進(jìn)行細(xì)胞同步化后分組,實(shí)驗(yàn)組分別加入含有3、0.6和0.12mg/ml紫花地丁水浸出物的培養(yǎng)液；陽性對(duì)照3TC組的終濃度為50μg/mL；不加藥物細(xì)胞對(duì)照組加入完全培養(yǎng)液。每孔均加入0.1 mL。每一濃度設(shè)5個(gè)平行孔?？瞻卓撞患蛹?xì)胞，只加培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)3d、6d和9d后，每3天更換含藥培養(yǎng)液1次。③MTT法檢測(cè)：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，采用酶標(biāo)儀波長(zhǎng)為490 nm（參考波長(zhǎng)630nm）測(cè)定各孔A值[1]。按下列公式計(jì)算細(xì)胞破壞率和半數(shù)毒性劑量（TC50）。細(xì)胞破壞率(%)=[(細(xì)胞對(duì)照組平均A值-實(shí)驗(yàn)組平均A值)/細(xì)胞對(duì)照組平均A值)]×100%。TC50=Antilog[A+(50-50%抑制百分率)×C/>50%抑制百分率-<50%抑制百分率]注：(A=log<50%藥物濃度,B=log>50%藥物濃度,C=B-A)。

1.5.3 細(xì)胞爬片的制備 將生長(zhǎng)良好的HepG2.2.15細(xì)胞用0.25﹪胰酶消化后制成細(xì)胞懸液，以3.5×105個(gè)/孔的密度接種于放有滅菌蓋玻片的6孔培養(yǎng)板，置于37℃、5﹪CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。貼壁后經(jīng)血清饑餓法細(xì)胞同步化處理后，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組：實(shí)驗(yàn)組加入3mg/mL紫花地丁水浸出物，陽性藥物對(duì)照組3TC濃度為50 μg/mL；細(xì)胞對(duì)照組加入完全培養(yǎng)液，每孔均加入2.0 mL。繼續(xù)培養(yǎng)3d后，取出爬片用PBS洗一次，冷丙酮固定10 min后，免疫熒光染色后上機(jī)檢測(cè)。

1.5.4 細(xì)胞爬片熒光染色法 已固定的細(xì)胞爬片用PBS洗5 min，在標(biāo)本上覆蓋1：5的抗-HBe、抗-HBs免疫血清，4℃冰箱中孵育過夜→用PBS漂洗3×3 min→細(xì)胞未干前復(fù)加二抗（羊抗人IgG-FITC 1:8）37℃濕盒1h→用PBS漂洗3×3 min→PI室溫避光作用15 min→用PBS漂洗3×3 min→封片劑封片后用LSCM觀察，并進(jìn)行熒光強(qiáng)度的定量分析。FITC和PI的激發(fā)波長(zhǎng)分別是488nm和535nm。FITC檢測(cè)HB sAg、HBeAg和 HBcAg；PI檢測(cè)細(xì)胞核酸。

加抗-HBc前先用0.1﹪Triton X-100+10﹪小牛血清PBS溶液37℃孵育15 min，余步驟同上。

計(jì)算抗原抑制率,公式如下:抗原抑制率＝（細(xì)胞對(duì)照組熒光強(qiáng)度－藥物處理組熒光強(qiáng)度）/細(xì)胞對(duì)照組熒光強(qiáng)度×100%。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，組間比較采用方差分析，各均數(shù)兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 紫花地丁的細(xì)胞毒性作用 在加入不同濃度的紫花地丁水浸出物和50μg/ml 3TC作用3d、6d和9d后，在倒置顯微鏡下觀察各紫花地丁水浸出物組細(xì)胞生長(zhǎng)良好。MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)紫花地丁水浸出物各濃度組均有不同程度促細(xì)胞生長(zhǎng)作用 (P<0.05)，50μg/mL 3TC在第9天有明顯細(xì)胞毒性作用（P<0.05）。

2.2 HBsAg、HBeAg和 HBcAg在 HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)的定位 LSCM下,HBsAg主要存在于細(xì)胞的胞漿、核膜和胞膜上；HBeAg主要在核內(nèi)和胞漿內(nèi)，核膜上沒有分布；HBcAg分布在胞漿和核內(nèi)（見圖1）。

表1 紫花地丁水浸出物、3TC在HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)中對(duì)細(xì)胞的作用(OD 490nm,±s,n=5)Tab.1 The cell toxicity of the different concentrations of Viola Yedoensis Makino extract and 3TC on HepG2.2.15 cells.(OD 490nm,±s,n=5)

表1 紫花地丁水浸出物、3TC在HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)中對(duì)細(xì)胞的作用(OD 490nm,±s,n=5)Tab.1 The cell toxicity of the different concentrations of Viola Yedoensis Makino extract and 3TC on HepG2.2.15 cells.(OD 490nm,±s,n=5)

注：與細(xì)胞對(duì)照組比較:*P<0.05,**P<0.01;紫花地丁水浸出物各濃度組與3TC組比較：△P<0.05,△△P<0.01

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圖1 激光共聚焦顯微鏡下HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)HBsAg、HBeAg和HBcAg的分布（×200）Fig 1 Location of HBsAg,HBeAg and HBcAg in HepG2.2.15 cells by LSCM（×200）

2.3 藥物對(duì)細(xì)胞內(nèi)HBsAg、HBeAg和HBcAg的影響 藥物處理3d后采用間接免疫熒光法標(biāo)記HBs Ag、HBeAg和HBcAg，并隨機(jī)選取5個(gè)視野，記錄100個(gè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。結(jié)果表明，紫花地丁水浸出物3mg/ml組對(duì)三種抗原均有抑制作用（P<0.01）；3TC 50μg/mL組對(duì)HBsAg和HBeAg有明顯抑制作用（P<0.01），但對(duì) HBcAg無抑制作用（P>0.05）。兩種藥物對(duì)HBsAg抑制作用無顯著差異（P>0.05），紫花地丁水浸出物對(duì)HBeAg和HBcAg抑制作用更強(qiáng)（P<0.05）。

3 討論

本試驗(yàn)主要研究紫花地丁水浸出物對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)HBsAg、HBeAg和HBcAg的影響以及三種抗原在細(xì)胞內(nèi)的分布，為進(jìn)一步了解紫花地丁對(duì)HBV的作用打下實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本研究將紫花地丁作用的細(xì)胞爬片，用抗-HBs、抗-HBe和抗-HBc特異性標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原，再用羊抗人IgG-FITC標(biāo)記一抗，在LSCM下直接觀察HBV抗原含量的變化。LSCM的激發(fā)光源為單波長(zhǎng)的激光，因而能有效地避免細(xì)胞的自發(fā)熒光和非特異性熒光的出現(xiàn)，使所采集的圖像更清晰可靠[4,5]；同時(shí)，由于LSCM采集的是一個(gè)光學(xué)層面的圖像，所以能夠準(zhǔn)確地定位出三種抗原在HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)的分布。結(jié)果表明HBsAg主要分布在胞漿和胞膜，HBeAg分布在核內(nèi)、胞漿和胞膜，HBcAg主要分布在核內(nèi)和胞漿內(nèi)。

表2 紫花地丁水浸出物和3TC在第3天對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)的HBsAg、HBeAg和HBcAg的影響Tab 2 The effect of Viola Yedoensis Makino estract and 3TC on HBsAg,HBeAg and HBcAg in HepG2.2.15 cells at 3th day.

我們?cè)C實(shí)紫花地丁對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞分泌的HBsAg和HBeAg具有抑制作用[6]，本研究擬觀察紫花地丁對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi) HBsAg、HBeAg和HBcAg的影響。結(jié)果表明紫花地丁對(duì)細(xì)胞內(nèi)三種抗原均有明顯抑制作用，其中對(duì)HBeAg的抑制作用優(yōu)于拉米夫定。HBeAg是HBV復(fù)制及具有強(qiáng)感染性的一個(gè)指標(biāo),對(duì)于病毒在感染宿主中的生命周期至關(guān)重要，同時(shí)也是病毒基因的輔助產(chǎn)物。紫花地丁對(duì)胞內(nèi)外HBeAg均有抑制作用，表明紫花地丁對(duì)HBV復(fù)制具有一定的抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)紫花地丁對(duì)HBcAg具有抑制作用，而拉米夫定無抑制HBcAg作用，HBcAg較HBsAg和HBeAg更能反映HBV的存在及其復(fù)制程度，它是HBV顆粒存在的直接標(biāo)志，其與HBV DNA呈正相關(guān)，都可反映HBV的活動(dòng)性復(fù)制。紫花地丁對(duì)HBcAg具有抑制作用,進(jìn)一步說明其對(duì)HBV具有抑制作用。紫花地丁作用導(dǎo)致HBsAg、HBeAg和HBcAg含量減少說明其具有一定的抗HBV作用，但其作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

激光共聚焦顯微鏡現(xiàn)已廣泛用于病毒的熒光定量測(cè)量，共焦圖像分析等方面的研究，今后必將在抗病毒藥物篩選中發(fā)揮越來越重要的作用。

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