GbE抑制哮喘大鼠炎癥細(xì)胞浸潤的實驗研究

李國豪，江慶瀾，梁成結(jié)，龍幼敏，梁顏笑，雷秀霞*

（1.廣州市第一人民醫(yī)院，廣東 廣州 510180；2.廣州醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510180）

支氣管哮喘(Asthma，以下簡稱哮喘)是一種多細(xì)胞、多因子介導(dǎo)的具有復(fù)雜免疫機制的氣道慢性炎癥，以氣道變應(yīng)性炎癥和氣道高反應(yīng)性為主要特征，表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的咳嗽、喘息、胸悶或呼吸困難，是臨床常見病和多發(fā)病。目前西醫(yī)治療哮喘常使用氨茶堿，能擴張支氣管有效緩解癥狀，但副作用明顯；而中醫(yī)治療哮喘遠(yuǎn)期效果較好，副作用少，尤其在治療本病緩解期及協(xié)助西醫(yī)鞏固發(fā)作期療效、降低西藥副作用方面具有優(yōu)勢。

我國藥典中記載銀杏葉具有潤肺、平喘、止痛等功效，用于肺虛咳嗽、冠心病和心絞痛等，我們較早前的研究已證實：銀杏葉提取物(GbE)可抑制由腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)的核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)基因轉(zhuǎn)錄活性從而緩解哮喘發(fā)作[1]。本研究擬通過探討GbE對哮喘大鼠炎癥細(xì)胞數(shù)量的改變揭示其平喘作用的部分機制。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑 卵蛋白(OVA)由Sigma公司提供；銀杏葉提取物即舒血寧注射液由萬榮三九藥業(yè)有限公司提供；氨茶堿由廣州白云山明興制藥有限公司提供。

1.2 實驗儀器 雅培CD3700全自動血球計數(shù)儀。

1.3 哮喘大鼠模型 體重230 g左右的清潔級雌性SD大鼠24只，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供。實驗大鼠分為4組，哮喘組、氨茶堿干預(yù)組每組7只，正常對照組和銀杏葉干預(yù)組每組5只。哮喘組、銀杏葉干預(yù)組和氨茶堿干預(yù)組大鼠首日致敏采用腹腔內(nèi)注射1 ml/只劑量的10%OVA和10%氫氧化鋁混合液。時隔1周后，在第8天以相同劑量、相同方法加強致敏1次；正常對照組以等量生理鹽水進(jìn)行腹腔內(nèi)注射。

1.4 藥物干預(yù)和對照 致敏后第15天，根據(jù)大鼠體重對銀杏葉(10 mg·kg-1·d-1)干預(yù)組、氨茶堿(25 mg·kg-1·d-1)組、哮喘對照組(生理鹽水)和正常對照組(生理鹽水)大鼠進(jìn)行灌胃干預(yù)，1 h后，再以2%OVA霧化誘喘30 min，隔天1次，連續(xù)7次，共兩周。

1.5 標(biāo)本采集和處理 每組5只大鼠均于末次激發(fā)12 h內(nèi)(哮喘組、氨茶堿干預(yù)組每組剩下的2只大鼠則于末次激發(fā)2 d和4 d后)以7%水合氯醛進(jìn)行腹腔注射麻醉，解剖，從左心室取血1 ml，注入EDTA抗凝管做WBC計數(shù)用，切取部分左肺上葉以10%的福爾馬林固定，HE染色做病理切片檢查。

2 結(jié)果

(1)銀杏葉干預(yù)組5只大鼠出現(xiàn)不同程度的呼吸困難、咳嗽、打噴嚏、煩躁或嘴唇發(fā)紺等癥狀；氨茶堿干預(yù)組7只大鼠也出現(xiàn)上述癥狀，但癥狀相對較輕；哮喘組7只大鼠出現(xiàn)呼吸急促困難、咳嗽、鼻中分泌物明顯、動作不協(xié)調(diào)、亂竄或顫抖等癥狀；正常對照組5只大鼠一直活動正常自如，狀態(tài)良好。

(2)銀杏葉干預(yù)組大鼠血中WBC為(9.45±1.66)×109/L，氨茶堿干預(yù)對照組為(8.29±2.22)×109/L，哮喘組為(12.99±2.46)×109/L，正常對照組為(7.29±1.89)×109/L，經(jīng)t檢驗銀杏葉組、氨茶堿組和正常對照組三組間WBC無顯著差異(P＞0.05)，但上述三組分別與哮喘組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

(3)銀杏葉干預(yù)組血液中EOS為(3.54±1.10)%；氨茶堿干預(yù)組為(2.26±1.64)%；哮喘組為(3.28±1.60)%；正常對照組為(1.86±1.19)%，從表1可見，4組之間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

(4)觀察4只于末次激發(fā)2 d內(nèi)和4 d后麻醉處死的大鼠，WBC含量均較低，但氨茶堿干預(yù)組[(5.72±0.91)×109/L]的大鼠WBC仍明顯低于哮喘組[(8.29±0.26)×109/L]大鼠，EOS未發(fā)現(xiàn)明顯變化[(1.42±0.1)%和(2.31±0.37)%]。

表1 各組動物模型血液WBC、EOS結(jié)果比較（±s）

表1 各組動物模型血液WBC、EOS結(jié)果比較（±s）

注：與正常對照組比較，*P＞0.05；與哮喘組比較，#P＜0.05。

組別EOS（%）實驗大鼠數(shù)量WBC（×109/L）銀杏葉干預(yù)組氨茶堿干預(yù)組哮喘組正常對照組3.54±1.10*2.26±1.64*3.28±1.60*1.86±1.1955559.45±1.66*8.29±2.22*＃12.99±2.46＃7.29±1.89

(5)肺部組織病理切片結(jié)果顯示，哮喘組大鼠肺支氣管壁增厚，細(xì)支氣管及周圍炎性細(xì)胞浸潤明顯，成堆聚集，炎癥細(xì)胞以中性粒細(xì)胞浸潤為主，大量黏液形成；氨茶堿干預(yù)組及銀杏葉干預(yù)組炎性細(xì)胞浸潤，氨茶堿干預(yù)組稍輕于銀杏葉干預(yù)組，兩藥物干預(yù)組上述組織學(xué)改變輕于哮喘組；正常對照組炎性細(xì)胞較少，但4組均未見嗜酸性粒細(xì)胞明顯增加(見圖1、圖2、圖3、圖4)。

圖1 哮喘組

圖2 氨茶堿干預(yù)組

圖3 銀杏葉干預(yù)組

圖4 正常對照組

3 討論

支氣管哮喘的本質(zhì)是氣道的非特異性炎癥，伴有炎癥細(xì)胞的浸潤和氧自由基的形成。研究證實，哮喘發(fā)作時中性粒細(xì)胞被激活，形成所謂的“呼吸爆發(fā)”，產(chǎn)生氧自由基等引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和組織器官的功能損害。本研究發(fā)現(xiàn)使用卵蛋白誘喘實驗大鼠后確實引起了大鼠氣道和血液白細(xì)胞(尤其是中性粒細(xì)胞)明顯增多，本組資料除正常對照組外，三個誘喘組均有不同程度的炎癥細(xì)胞浸潤，結(jié)果提示：銀杏葉提取物和氨茶堿能降低但不能完全抑制哮喘大鼠血液和肺組織WBC浸潤，與胡娜等[2]報道一致。

哮喘發(fā)作時，由于B細(xì)胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)在EOS膜上的表達(dá)增加，患者外周血及氣道內(nèi)EOS均明顯增多；隨著病情的改善，EOS的凋亡增加，其數(shù)量又明顯減少。Yasui等[3]發(fā)現(xiàn)氨茶堿是通過下調(diào)EOS上Bcl-2的表達(dá)來促進(jìn)EOS凋亡，因此，EOS上Bcl-2的表達(dá)增加可抑制EOS凋亡。本研究未見銀杏葉干預(yù)組和氨茶堿組EOS數(shù)量的明顯減少，與Yasui等[3]和吳美玲等[4]報道不符。據(jù)報道，支氣管哮喘時嗜酸性粒細(xì)胞可輕度增高，其含量與氣道氣流阻塞程度有關(guān)，在抗原作用晚期，支氣管高反應(yīng)性與嗜酸性粒細(xì)胞計算呈負(fù)相關(guān)[5]。由此推測，本實驗結(jié)果顯示嗜酸性粒細(xì)胞升降幅度與報道不相符的原因之一，可能是因為本實驗從誘喘到處死大鼠整個過程持續(xù)時間過長，未找到最佳激發(fā)誘喘時間。

已有的研究證實，GbE的親脂性物質(zhì)主要成分是24%的黃酮甙和6%的萜烯，黃酮甙是有效的自由基清除劑，能夠提高細(xì)胞在哮喘時對缺氧的耐受，減少自由基的生成，并保護(hù)氣道細(xì)胞免遭自由基的損傷。萜烯除了能夠抑制血小板激活因子（PAF）對EOS及中性粒細(xì)胞的趨化作用，減少肺組織中EOS的浸潤，抑制支氣管痙攣，還同時減輕PAF釋放的炎癥介質(zhì)、毒性蛋白和酶對氣道的損傷，減輕氣道炎癥作用[6]。本實驗結(jié)果顯示，氨茶堿干預(yù)組和銀杏葉干預(yù)組均能降低實驗大鼠血液和肺組織炎癥細(xì)胞的浸潤程度，證實銀杏葉提取物對抑制炎癥細(xì)胞浸潤，緩解哮喘癥狀有一定的療效。本課題下階段的工作將著重于優(yōu)化檢測EOS的最佳時間并探討銀杏葉提取物平喘的部分分子生物學(xué)機制。

[1]李國豪,雷秀霞,衣艷梅,等.銀杏葉提取物對核因子-κB轉(zhuǎn)錄通路干預(yù)作用的研究[J].中藥材,2008,31(9):1357-1360.

[2]胡 娜,王 紅,呂 兵,等.銀杏葉提取物拮抗哮喘大鼠氣道炎癥的機制探討[J].實用醫(yī)學(xué)雜志,2009,25(16):2646-2648.

[3]Yasui K,Nakazawa T,Agematsu K.Theophylline accelerates human granulocyte apoptosis not via phosphodiesterase inhibition[J].JClin Invest,1997,100(7):1677-1684.

[4]吳美玲,林益平,金志華,等.銀杏葉提取物對哮喘大鼠氣道嗜酸性粒細(xì)胞浸潤的影響[J].金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報,2008,8(2):9-13.

[5]熊立凡.臨床檢驗基礎(chǔ)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2003:43-46.

[6]潘洪平.銀杏葉制劑藥理作用和臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J].中國中藥雜志,2005,30(2):93-96.