二倍體和三倍體虹鱒外周血細(xì)胞的比較研究

陳俠君，王炳謙，劉 奕，范兆廷*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，哈爾濱 150070）

虹鱒（Onchorynchus mykiss）屬于鮭形目（Salmoniformes），鮭科（Salmonidae），是世界性的冷水性養(yǎng)殖魚類。由于育性不良或者不育，三倍體魚類可以將能量完全用于營養(yǎng)生長，性成熟后在生長和肌肉質(zhì)量方面表現(xiàn)出較強(qiáng)的優(yōu)勢。三倍體育種在鯉鯽雜種及虹鱒、團(tuán)頭魴、羅非魚、牡蠣、鮑魚和扇貝等水產(chǎn)動(dòng)物中得到廣泛的應(yīng)用[1-5]。虹鱒的卵子體積大、胚胎發(fā)育時(shí)間長，易于進(jìn)行各種染色體倍性的遺傳操作，三倍體苗種生產(chǎn)容易，易于普及推廣。三倍體虹鱒在幼魚階段時(shí)生長速度稍慢，但雌性的性腺不發(fā)育，幾乎沒有成熟死亡現(xiàn)象，三倍體虹鱒的個(gè)體大，肌肉質(zhì)量好，可加工為上乘的三文魚；同時(shí)三倍體虹鱒對水霉病和傳染性造血器官壞死病（IHN）抵抗力強(qiáng)[6-8]，受到生產(chǎn)者和消費(fèi)者的青睞。

在對多倍體的血液研究中，往往側(cè)重于紅細(xì)胞的DNA含量或細(xì)胞核體積的測量，對于基因組成倍增加后，紅細(xì)胞核的形態(tài)發(fā)生的變異及變異的原因和構(gòu)成外周血的主要成分白細(xì)胞的變化則罕有研究。文章對二倍體和三倍體虹鱒的紅細(xì)胞、白細(xì)胞的形態(tài)進(jìn)行了比較分析，以其為豐富虹鱒血細(xì)胞形態(tài)學(xué)、血液生理學(xué)、人工誘導(dǎo)三倍體虹鱒以及三倍體虹鱒的鑒定提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

三倍體虹鱒（Onchorynchus mykiss）由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所王炳謙課題組通過靜水壓力方法獲得并培育；二倍體虹鱒系同期人工繁殖獲得。二者均飼養(yǎng)于中國水產(chǎn)科學(xué)院黑龍江水產(chǎn)研究所渤海冷水魚類實(shí)驗(yàn)站。2008年3月隨機(jī)選擇體表無傷、發(fā)育正常的三倍體及同期二倍體虹鱒各20尾，其體重及叉長見表1。

表1 試驗(yàn)用虹鱒基本情況Table 1 Basic circumstance of Onchorynchus mykiss

1.2 方法

用1%肝素浸潤的1 mL注射器從魚尾靜（動(dòng)）脈采血，制作血涂片，自然風(fēng)干后用甲醇固定，瑞氏染液染色，清水沖洗干凈，自然干燥。

在光學(xué)顯微鏡下觀察各種細(xì)胞的形態(tài)特征，測量各種白細(xì)胞、成熟紅細(xì)胞和成熟紅細(xì)胞核的長徑（b）與短徑（a）。每個(gè)樣本各測量50個(gè)細(xì)胞，取其平均值，根據(jù)公式S=πab/4計(jì)算紅細(xì)胞和紅細(xì)胞核的面積；根據(jù)公式V=a2b/1.91計(jì)算白細(xì)胞、紅細(xì)胞和紅細(xì)胞核的體積[9]，根據(jù)公式核質(zhì)比=細(xì)胞核體積/細(xì)胞質(zhì)體積[10]計(jì)算紅細(xì)胞的核質(zhì)比；統(tǒng)計(jì)三倍體虹鱒1 000個(gè)紅細(xì)胞中異常紅細(xì)胞的百分比，并對異常紅細(xì)胞的種類及所占比例進(jìn)行分析；計(jì)數(shù)二倍體和三倍體虹鱒血涂片中的白細(xì)胞，并分類。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 二倍體與三倍體虹鱒紅細(xì)胞大小及形態(tài)異常紅細(xì)胞的比較

二倍體與三倍體虹鱒的紅細(xì)胞及核的大小測量結(jié)果及二者之間的差異顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 二倍體和三倍體虹鱒紅細(xì)胞及其細(xì)胞核大小比較Table 2 Comparison on size of erythrocyte and cellular nucleus in diploid and triploid rainbow trout (μm)

由表2可以看出，三倍體虹鱒各項(xiàng)數(shù)值都高于二倍體，三倍體虹鱒紅細(xì)胞長徑、紅細(xì)胞短徑、紅細(xì)胞體積、紅細(xì)胞面積、核長徑、核體積以及核面積分別為二倍體的1.30、1.11、1.58、1.43、1.38、1.45、1.34倍，差異極顯著（P＜0.01）；三倍體虹鱒紅細(xì)胞核短徑與二倍體差異不顯著（P＞0.05）。其中二倍體個(gè)體的紅細(xì)胞長徑的平均值為 12.12 μm，而三倍體個(gè)體的紅細(xì)胞長徑的平均值為15.71 μm；三倍體紅細(xì)胞短徑/長徑比值為0.57，小于二倍體的比值0.67；三倍體虹鱒和二倍體虹鱒的核質(zhì)比均為0.82。三倍體虹鱒中63%的紅細(xì)胞呈長橢圓形，17%的紅細(xì)胞有啞鈴形細(xì)胞核或分裂的細(xì)胞核，其中啞鈴形紅細(xì)胞占所有形態(tài)異常紅細(xì)胞的47.92%，均等分裂的紅細(xì)胞占20.83%，不均等分裂紅細(xì)胞占31.25%。本研究中未見二倍體虹鱒的紅細(xì)胞有啞鈴形細(xì)胞核和分裂的細(xì)胞核現(xiàn)象。

2.2 二倍體與三倍體虹鱒的白細(xì)胞分類記數(shù)及大小比較

由表3可知，虹鱒白細(xì)胞構(gòu)成特點(diǎn)是以血栓細(xì)胞為主，其次為淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞，單核細(xì)胞極少，沒有發(fā)現(xiàn)嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞，其中二倍體和三倍體在淋巴細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞上有較大差異。從表4中可以看到，三倍體虹鱒白細(xì)胞的長徑和短徑都大于二倍體；嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞的體積與倍性的1.5：1比例相接近；淋巴細(xì)胞、血栓細(xì)胞的大小雖然沒有表現(xiàn)出相應(yīng)的比例，但三倍體虹鱒的淋巴細(xì)胞、血栓細(xì)胞與二倍體虹鱒相應(yīng)細(xì)胞之間在體積上存在顯著性差異。

表3 白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)值Table 3 Differential leucocyte counts（DLC）(%)

表4 二倍體和三倍體虹鱒白細(xì)胞大小比較Table 4 Comparison on size of leucocyte in diploid and triploid rainbow trout (μm)

2.3 二倍體與三倍體虹鱒血細(xì)胞形態(tài)的觀察

2.3.1 紅細(xì)胞形態(tài)觀察

在二倍體和三倍體虹鱒的血涂片上均可以觀察到原紅細(xì)胞、幼紅細(xì)胞以及成熟的紅細(xì)胞，偶然可見衰老的紅細(xì)胞和核影細(xì)胞。

兩種倍性虹鱒的原紅細(xì)胞呈圓形或近圓形，細(xì)胞核也呈圓形，居中，核質(zhì)比大，染色質(zhì)成網(wǎng)狀，染成淺紫色，細(xì)胞質(zhì)較少染成淺藍(lán)色（見圖版Ⅰ-1、2）；幼紅細(xì)胞圓形或略成橢圓形，和成熟的紅細(xì)胞形狀相差不大，常成群出現(xiàn)，其核比成熟的紅細(xì)胞稍大，圓形或橢圓形，核質(zhì)比較大，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)疏松，著色較淺，細(xì)胞質(zhì)明顯增多，染成較淺藍(lán)色（見圖版Ⅰ-3、4）。

圖版Ⅰ 二、三倍體虹鱒血細(xì)胞的形態(tài)PlateⅠ Morphology of blood cells in diploid and triploid rainbow trout

無論是三倍體還是二倍體，成熟的紅細(xì)胞長橢圓形，表面光滑，核橢圓形，位于細(xì)胞中央，染色質(zhì)致密，核質(zhì)比小，染成絳紫色，細(xì)胞質(zhì)染成非常淺的藍(lán)色（見圖版Ⅰ-5、6）；三倍體中可見到一些異常的紅細(xì)胞，有的呈啞鈴狀，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)陷（見圖版Ⅰ-7），有的細(xì)胞內(nèi)有兩個(gè)分開的小核，一大一?。ㄒ妶D版Ⅰ-8），或大小均等（見圖版Ⅰ-9），有的是細(xì)胞質(zhì)已分開但核沒分開（見圖版Ⅰ-10）。

衰老的紅細(xì)胞較正常的紅細(xì)胞大，核也大，染色質(zhì)成疏松的網(wǎng)狀，染成淺紫紅色，細(xì)胞質(zhì)著色很淺接近白色（見圖版Ⅰ-11、12）。

核影紅細(xì)胞似裸核，染色質(zhì)疏松網(wǎng)狀，染成淡紫紅色，無細(xì)胞質(zhì)（見圖版Ⅰ-13、14）。

2.3.2 白細(xì)胞形態(tài)觀察

血栓細(xì)胞：細(xì)胞極小，是血細(xì)胞中最小的細(xì)胞，呈圓形、不規(guī)則圓形、短棒狀或紡錘形；細(xì)胞核占細(xì)胞的大部分，呈腎形（見圖版Ⅰ-15、16）、紡錘形（見圖版Ⅰ-17、18）、圓形（見圖版Ⅰ-19、20）或短棒狀（見圖版Ⅰ-21、22）；核中有稠密的染色質(zhì)，著色很深，染成深紫色；細(xì)胞質(zhì)僅一薄層，或有時(shí)不清，繞核零星分布，邊界模糊，淡藍(lán)色或透明色。血栓細(xì)胞在血涂片中常單個(gè)、成隊(duì)、數(shù)個(gè)或數(shù)十幾個(gè)聚集在一起（見圖版Ⅰ-23、24），在顯微鏡下十分容易辨認(rèn)。在三倍體中還能觀察到很多啞鈴形的血栓細(xì)胞（見圖版Ⅰ-25），另外，三倍體以紡錘形血栓細(xì)胞為主，而二倍體以圓形血栓細(xì)胞為主。

淋巴細(xì)胞：僅比血栓細(xì)胞略大，細(xì)胞有大有小，多為圓形、腎形或不規(guī)則形狀（見圖版Ⅰ-26、27）；多數(shù)核有清晰可見的缺刻（見圖版Ⅰ-28）；核染色質(zhì)濃密，呈粗網(wǎng)狀，著色較深，染成紫色。淋巴細(xì)胞核幾乎占據(jù)整個(gè)細(xì)胞，位于細(xì)胞中央或與質(zhì)膜相切；細(xì)胞質(zhì)較少，在核外圍成窄環(huán)或僅在核的一側(cè)出現(xiàn)，呈弱嗜堿性，染成淡藍(lán)色或天藍(lán)色；有的邊緣平整，有的可見鈍形的胞質(zhì)突起。胞質(zhì)極少的淋巴細(xì)胞與裸核狀球形血栓細(xì)胞有時(shí)很難區(qū)分。

嗜中性粒細(xì)胞：細(xì)胞呈圓形或不規(guī)則圓形，邊緣較為平整。核的形狀不十分規(guī)則，呈腎形、馬蹄形、螺旋形或分葉形，位于細(xì)胞中央，或偏居于細(xì)胞一側(cè)，常與質(zhì)膜相切，約占細(xì)胞的1/3。核中染色質(zhì)濃密，染色較深；胞質(zhì)著色較淺，染成灰藍(lán)色，有的細(xì)胞能看見其中有微小的藍(lán)紫色顆粒。血涂片上，嗜中性粒細(xì)胞有時(shí)與單核細(xì)胞難以區(qū)分，但前者胞體較圓，表面較光滑，胞核較小，胞質(zhì)染色較淡。二倍體和三倍體中均有中有螺旋形（見圖版Ⅰ-29、30）、二分葉（見圖版Ⅰ-31、32）、三分葉形（見圖版Ⅰ-33、34）核嗜中性粒細(xì)胞，而二倍體中腎形核嗜中性粒細(xì)胞（見圖版Ⅰ-35）、三倍體中有四分葉形（見圖版Ⅰ-36）、馬蹄形（見圖版Ⅰ-37）、桿狀（見圖版Ⅰ-38）核。

單核細(xì)胞：在外周血液中數(shù)量很少，圓形或近圓形，邊緣較粗糙，核呈不規(guī)則的圓形或不規(guī)則多邊形，較大，位于細(xì)胞中央或偏心位，核中染色質(zhì)分布疏松，成網(wǎng)狀，胞質(zhì)豐富，著色較淺，染成灰藍(lán)色，有藍(lán)紫色顆粒分布（見圖版Ⅰ-39、40）。

3 討論與結(jié)論

由于基因組大小的不同，不同倍性細(xì)胞核體積比值存在較大的差異。馬濤等報(bào)道二倍體與四倍體虹鱒細(xì)胞核體積的比值為1：2.42[11]；朱藍(lán)菲等在研究人工同源和異源三倍體鰱時(shí)，發(fā)現(xiàn)同源三倍體紅細(xì)胞核體積為二倍體的1.63倍[9]；鰱×鳙及鰱×團(tuán)頭魴異源三倍體紅細(xì)胞核體積則分別是二倍體的2.04倍和1.85倍。俞小牧等則發(fā)現(xiàn)異源四倍體、四倍體和倍間三倍體白鯽（Carassius curieri）的細(xì)胞核體積分別是二倍體的1.83，1.98和1.43倍，接近理論值2.00倍和1.50倍[12]。本研究結(jié)果表明，三倍體虹鱒的核體積約為二倍體的1.5倍，表明通過測量紅細(xì)胞核體積能較準(zhǔn)確反映出多倍體的倍性。

一般認(rèn)為，細(xì)胞大小與DNA的含量或染色體數(shù)量有關(guān)。為維持恒定的核質(zhì)比例，隨著染色體數(shù)目增多，多倍體的細(xì)胞及細(xì)胞核通常要比二倍體大[13]。本研究結(jié)果表明，虹鱒三倍體的核體積約為二倍體的1.5倍，并且三倍體和二倍體的紅細(xì)胞體積分別為658.50和417.25，比值接近1.5，依倍性增加而且同比例增大。

研究發(fā)現(xiàn)三倍體虹鱒的紅細(xì)胞形態(tài)與二倍體相比發(fā)生了一定的變化，有近17%的啞鈴狀或雙核紅細(xì)胞。俞小牧等對異源四倍體白鯽及倍間三倍體白鯽的研究也發(fā)現(xiàn)異常紅細(xì)胞（啞鈴形或雙核）出現(xiàn)率分別為7.6%和10.12%[12]；劉巧等報(bào)道的異源四倍體鯽鯉有33%的紅細(xì)胞核為啞鈴形、三倍體湘云鯽有25%的紅細(xì)胞核為啞鈴形[1]。因此可將該現(xiàn)象作為區(qū)別多倍體與二倍體的一個(gè)重要標(biāo)志。虹鱒三倍體中產(chǎn)生異常紅細(xì)胞的原因目前尚不能得到合理的解釋，可能是由于三倍體紅細(xì)胞存在一些異常無絲分裂，而使得部分紅細(xì)胞停留在無絲分裂的不同階段。若要對此現(xiàn)象作出明確的結(jié)論，還需要對三倍體魚類造血器官的生理特點(diǎn)以及紅細(xì)胞的發(fā)生過程進(jìn)行深入研究，以尋找其組織學(xué)和細(xì)胞學(xué)證據(jù)。

虹鱒外周血白細(xì)胞中的血栓細(xì)胞和淋巴細(xì)胞占有相當(dāng)大的比例，在二倍體和三倍體虹鱒中均未發(fā)現(xiàn)嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞。在魚類外周血液中是否存在嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞，以往的研究已有較多論述[14-18]。筆者傾向于認(rèn)為嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞客觀存在，但數(shù)量較少，或者我們制片過程中導(dǎo)致了嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞解體而無法得見。

白細(xì)胞的主要作用是保護(hù)機(jī)體，抵御病害的侵襲，在機(jī)體的免疫反應(yīng)中起主要作用[19]。白細(xì)胞數(shù)量的差別可用于解釋魚類的抗病和在特定環(huán)境下的耐受能力。三倍體虹鱒白細(xì)胞中嗜中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞都顯著多于二倍體，可能與三倍體抗病能力強(qiáng)有關(guān)。

二倍體虹鱒的血栓細(xì)胞在血涂片上表現(xiàn)出各種形態(tài)：有圓形、腎形、紡錘形、短棒形；除以上形狀外，三倍體虹鱒還有啞鈴形；四倍體鯽鯉的血栓細(xì)胞有卵圓形、長桿形、大頭釘形三種形態(tài)[1]；歐洲鰻鱺表現(xiàn)為5種形態(tài)[20]；這顯示了血栓細(xì)胞的形態(tài)因種類而異。

Barber等認(rèn)為許多淋巴細(xì)胞的體積是連續(xù)變化的，不能用“大”“小”來界定[17]。Ellis指出，將淋巴細(xì)胞分為“大”“小”是武斷的，因?yàn)樗鼈兛赡艽砹送环N細(xì)胞的不同功能狀態(tài)，而不大可能是具有不同功能的兩種細(xì)胞[18]。因此，有研究者將其歸為一類進(jìn)行描述[21-23]。但也有人認(rèn)為它們是具有不同功能的兩類細(xì)胞[24-25]。在本試驗(yàn)中，通過觀察和測量，淋巴細(xì)胞的大小和染色深淺有一定的連續(xù)性，而且較大者胞質(zhì)染色較深，這與“未成熟的細(xì)胞往往較已成熟者大（巨核細(xì)胞系除外）”，“細(xì)胞愈年幼，RNA含量愈多，與瑞氏染液中的堿性美藍(lán)有親和力，漿染色愈藍(lán)”的規(guī)律相符合[26]，因此可以認(rèn)為是淋巴細(xì)胞的不同功能狀態(tài)，故應(yīng)歸為一類。

二倍體虹鱒嗜中性粒細(xì)胞有腎形、螺旋形、二分葉、三分葉形核，而三倍體中無腎形核、有馬蹄形、螺旋形、二分葉、三分葉，四分葉形核。腎形核、馬蹄形核和四分葉核可作為區(qū)分二倍體虹鱒與三倍體虹鱒的另一重要鑒定標(biāo)志。

由此可知，兩種倍性虹鱒的紅細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、血栓細(xì)胞的形態(tài)均存在差異，尤其以紅細(xì)胞的差異最為明顯。三倍體虹鱒外周血中近17%的紅細(xì)胞有啞鈴形細(xì)胞核或雙核而二倍體虹鱒中未觀察到這種畸形細(xì)胞，因此這種現(xiàn)象可以作為區(qū)別三倍體與二倍體的一個(gè)重要標(biāo)志。

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