劉曉飛,高學(xué)軍*,劉 營,敖金霞,王青竹
(1.乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,東北農(nóng)業(yè)大學(xué),哈爾濱 150030;2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物技術(shù)研究中心,哈爾濱 150030)
賴氨酸(Lysine)的化學(xué)名稱為2,6-二氨基己酸,有L-型(左旋)、D-型(右旋)和DL型(消旋)三種旋學(xué)異構(gòu)體。人類和動物可吸收利用的只有L-型。它對調(diào)節(jié)體內(nèi)代謝平衡、提高體內(nèi)對谷類蛋白質(zhì)的吸收、改善人類膳食營養(yǎng)和動物營養(yǎng)、促進(jìn)生長發(fā)育均有重要作用。飼料中添加賴氨酸對單胃動物極其重要,如豆粕中添加適量的賴氨酸,可以大大提高蛋白質(zhì)的利用率,促進(jìn)禽畜生長。賴氨酸還決定斷奶仔豬體內(nèi)蛋白質(zhì)合成、沉積以及其他氨基酸的利用率,賴氨酸轉(zhuǎn)化為體蛋白的效率高達(dá)86%[1]。賴氨酸應(yīng)用范圍較廣目前,有90%的賴氨酸應(yīng)用于飼料工業(yè),尤其是2003年以后,我國已成為全球最大的賴氨酸生產(chǎn)國。本文從賴氨酸生產(chǎn)現(xiàn)狀、生物合成途徑、發(fā)酵調(diào)節(jié)機(jī)制、微生物應(yīng)用等方面綜述了微生物產(chǎn)賴氨酸的研究現(xiàn)狀及應(yīng)用前景。
L-賴氨酸最初是從蛋白質(zhì)水解物中分離得到的,蛋白質(zhì)水解法一般以動物血粉為原料,此法特點(diǎn)是工藝簡單,但原料來源有限,僅適合小規(guī)模生產(chǎn)。后又出現(xiàn)了化學(xué)合成法、酶法,使用的合成法主要有荷蘭的DMS(Dutch State Mijinen)法和日本的東麗法,此法最大缺點(diǎn)是使用劇毒原料光氣,可能殘留催化劑,產(chǎn)品安全性差,存在嚴(yán)重的環(huán)保問題[2]。1960年,日木首先采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)。微生物發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸是人為地解除氨基酸生物合成的代謝控制機(jī)制,使其積累大量所需氨基酸。氨基酸的L-型立體專一性決定了發(fā)酵法生產(chǎn)氨基酸較化學(xué)合成的工藝更簡單、快捷。我國于20世紀(jì)60年代中期開始進(jìn)行賴氨酸菌株選育和發(fā)酵的研究,但因產(chǎn)量較低難以工業(yè)化。直到70年代末80年代初世界賴氨酸實(shí)現(xiàn)工業(yè)化后我國研究才取得突破。目前,世界約2/3的賴氨酸企業(yè)采用發(fā)酵法生產(chǎn),生產(chǎn)的為L-型賴氨酸,生產(chǎn)工藝已基本成熟。近年來,賴氨酸的需求逐年增加,全世界每年大概80萬t賴氨酸通過發(fā)酵生產(chǎn)的方式獲得。
用于工業(yè)上發(fā)酵生產(chǎn)賴氨酸的菌株主要是棒狀桿菌和短桿菌等細(xì)的變異株,棒狀桿菌具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[3],其中谷氨酸棒狀桿菌應(yīng)用最為廣泛[4]。此外,賴氨酸生產(chǎn)還有應(yīng)用大腸桿菌[5]、黃色短桿菌[6]、釀酒酵母[7]、乳酸發(fā)酵短桿菌[8]、假絲酵母[9]等的報(bào)道。
生產(chǎn)賴氨酸的微生物主要有四類:野生型、營養(yǎng)突變型、調(diào)節(jié)突變型和營養(yǎng)調(diào)節(jié)突變型。工業(yè)上通過優(yōu)化發(fā)酵菌種(誘變和基因工程手段)和改變發(fā)酵條件(攪拌速度、pH、溶氧、溫度和CO2)來提高賴氨酸產(chǎn)量。獲得高產(chǎn)微生物菌株的方法主要有傳統(tǒng)誘變方法(紫外線、X射線、氮芥和亞硝基酯等)、原生質(zhì)體融合和基因工程方法等。據(jù)報(bào)道,經(jīng)過誘變菌株產(chǎn)生的賴氨酸提高40%~50%。誘變菌株以價(jià)格低廉的碳源為發(fā)酵原料,如各種淀粉水解糖、蜜糖、醋酸和乙醇等,發(fā)酵生產(chǎn)賴氨酸,通過分離、濃縮、蒸發(fā)、結(jié)晶、干燥生產(chǎn)工藝獲得飼料級賴氨酸、再精制可得到食品級、醫(yī)藥級產(chǎn)品[10]。
天冬氨酸途徑又稱二氨基庚二酸途徑,此途徑多存在細(xì)菌、綠藻、原蟲和高等植物中,以天冬氨酸為起始物質(zhì),還可以合成蘇氨酸、蛋氨酸和異亮氨酸[11]。
α-氨基己二酸途徑存在于酵母和霉菌中。酵母主要是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisia),霉菌主要是粗糙脈孢菌(Neurspora crassa)。
抗類似物突變株也稱為代謝拮抗無抗性突變株。選育抗類似物突變株,是目前代謝控制發(fā)酵育種的主流。選育抗類似物突變株,因?yàn)榇x調(diào)節(jié)可被遺傳性地解除,在發(fā)酵時(shí)可不再受培養(yǎng)基成分的影響,代謝較為穩(wěn)定。另外,抗類似物突變株還具有不易發(fā)生回復(fù)突變的優(yōu)點(diǎn)。添加賴氨酸的結(jié)構(gòu)類似物是采用切斷或減弱支路代謝的方法來增加賴氨酸的積累。由于限制高絲氨酸(Homaserine,Hom)的補(bǔ)給量,使蘇氨酸(Threonine,Thr)和蛋氨酸(Methionine,Met)的生成有限,從而解除了Thr和Lys對天冬氨酸激酶(Aspartate Kinase,AK)的協(xié)同反饋抑制,使Lys得以積累。s-(β-氨基乙基)L-半胱氨酸(S-(β-aminoethyl)-L-cysteine hydrochloride,AEC)是生產(chǎn)賴氨酸常用的結(jié)構(gòu)類似物。
Aida等從日本土壤中分離得到的野生型枯草芽孢桿菌產(chǎn)賴氨酸2.5 g·L-1[12]。Chaudhurl等使用從印度土壤中分離得到的枯草芽孢桿菌[13],依照Adelberg的方法加入濃度為300 μg·mL-1N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍[14](N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine(carcinogen,mutagen),MNNG),在培養(yǎng)基中加入20 mmol·L-1AEC后得到的突變株產(chǎn)賴氨酸16 g·L-1,再經(jīng)60 s的紫外線照射后的突變株產(chǎn)賴氨酸21 g·L-1。Sands等使用乳酸桿菌經(jīng)過AEC四次誘變,原始菌株的賴氨酸產(chǎn)量不足1 μg·mL-1,而突變株賴氨酸產(chǎn)量達(dá)到72 μg·mL-1[15]。張偉國等以黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)ATCC14067出發(fā),經(jīng)過亞硝基胍(Nitrosoguanidine,NTG)、硫酸二乙酯(Diethyl Sulfate,DES)逐級誘變處理,用AEC、磺胺胍(Sulfaguanidine,SG)等氨基酸結(jié)構(gòu)類似物及琥珀酸為唯一碳源平板定向育種,獲得1株L-賴氨酸高產(chǎn)菌,L-賴氨酸鹽酸鹽產(chǎn)量達(dá)77~82 g·L-1[16]。Jose等以釀酒酵母為出發(fā)菌株,加入賴氨酸的結(jié)構(gòu)類似物AEC,以脯氨酸為氮源,得到的突變株產(chǎn)賴氨酸是野生株的3~7倍[17]。
改變細(xì)胞膜透性選育賴氨酸高產(chǎn)菌株是行之有效的選育途徑,賴氨酸是在菌體內(nèi)合成后,通過細(xì)胞膜滲透到發(fā)酵液中的。如果能夠改變細(xì)胞膜的通透性,一方面可以使產(chǎn)物易于提取,另一方面可以降低產(chǎn)物在菌體中濃度,使產(chǎn)物不能引起反饋抑制或阻遏作用。
齊秀蘭等利用L-賴氨酸產(chǎn)生菌鈍齒棒桿菌(Corynebacterium crenatum)D60-95經(jīng)紫外線誘變,使用七葉苷篩選抗性菌株,獲得高產(chǎn)穩(wěn)定菌株E0.9-37,L-賴氨酸產(chǎn)量為82.0 g·L-1,較出發(fā)株提高20.6%。通過優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基使菌株E0.9-37 L-賴氨酸產(chǎn)量高達(dá)111.0 g·L-1,較出發(fā)菌株提高了63.2%[18]。試驗(yàn)證明,七葉苷對于改善細(xì)胞的通透性有一定作用。潘中明等以乳酸發(fā)酵短桿菌AL039為出發(fā)株,經(jīng)亞硝基胍誘變,篩選到一株氟丙酮酸敏感型突變株FP094,其賴氨酸產(chǎn)量比出發(fā)菌株提高37.5%,當(dāng)添加生物素的量在200~500 μg·L-1時(shí),可以明顯地提高賴氨酸的產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率,證明高濃度的生物素對乳酸發(fā)酵短桿菌高產(chǎn)賴氨酸是有利的,因?yàn)樘砑舆^量生物素會導(dǎo)致生物細(xì)胞膜中更多的磷脂分子合成,限制了谷氨酸和天冬氨酸向胞外的分泌,從而使細(xì)胞內(nèi)的谷氨酸對谷氨酸脫氫酶等產(chǎn)生反饋抑制,迫使代謝流向合成天冬氨酸的方向進(jìn)行,天冬氨酸進(jìn)而合成賴氨酸[19]。
增加天冬氨酸濃度,天冬氨酸激酶與底物的親和力協(xié)同性增大,能夠抵消變構(gòu)抑制劑的影響,使前體物(丙酮酸、草酰乙酸、天冬氨酸等)充分地用于合成賴氨酸。
從葡萄糖形成賴氨酸的過程中,依賴于天冬氨酸生成的量。天冬氨酸是乳酸發(fā)酵短桿菌生產(chǎn)賴氨酸的前體物。賴氨酸是從丙酮酸和天冬氨酸反應(yīng)轉(zhuǎn)變形成的。丙酮酸激酶在變構(gòu)調(diào)控作用下,化醇丙酮酸不可逆變地轉(zhuǎn)化成丙酮酸[20]。Osaka等從乳酸發(fā)酵短桿菌AJ3990出發(fā),誘發(fā)得到β-氟丙酮酸鈉(EP)-敏感突變株AJ11204。AJ11204以葡萄糖為碳源,發(fā)酵在32℃進(jìn)行,用加入氣態(tài)氨調(diào)節(jié)pH在6.5,同時(shí)補(bǔ)充氧保持在0.01~0.10個(gè)大氣壓[21]。在過量生物素存在的條件下,發(fā)酵48 h積累賴氨酸70 g·L-1,葡萄糖轉(zhuǎn)化率為50%。EP-敏感突變株的丙酮酸脫氫酶活性減弱,為出發(fā)菌株的27%,增加了丙酮酸在細(xì)胞內(nèi)的濃度,大量積累賴氨酸的前體物天冬氨酸,從而得到高產(chǎn)賴氨酸的菌株。
Shvinka等指出賴氨酸合成中間產(chǎn)物草酰乙酸可由三羧酸循環(huán)或磷酸烯醇丙酮酸羧化途徑獲得[22]。乙酰CoA促進(jìn)磷酸烯醇式丙酮酸羧化作用,添加醋酸可以增加乙酰CoA的生成,促進(jìn)磷酸烯醇式丙酮酸羧化反應(yīng)[23]。此外,添加醋酸可以誘導(dǎo)乙醛酸支路,可以補(bǔ)充草酰乙酸及三羧酸途徑的中間產(chǎn)物,從而促進(jìn)菌體生長和賴氨酸合成[24]。潘中明等通過試驗(yàn)驗(yàn)證,醋酸鈣加量在2%左右對賴氨酸發(fā)酵最為理想[19]。
原生質(zhì)體融合技術(shù)是微生物遺傳育種上一項(xiàng)重要技術(shù),它具有遺傳信息傳遞量大,不受親緣關(guān)系的影響,可有目的地選擇親株以選育理想的融合株,便于操作等優(yōu)點(diǎn),在遺傳育種中具有廣闊的應(yīng)用前景。
樓純菊等進(jìn)行了提高產(chǎn)朊假絲酵母體內(nèi)賴氨酸含量的研究。通過蝸牛酶和溶壁酶制備產(chǎn)朊假絲酵母原生質(zhì)體,將形成的原生質(zhì)體紫外誘變處理來提高賴氨酸產(chǎn)量,所得突變株的賴氨酸含量達(dá)到8.46 g·L-1,比對照株高 41%[25]。
利用基因工程技術(shù)構(gòu)建氨基酸工程菌株,把依靠誘變技術(shù)取得的優(yōu)良特性通過重組DNA技術(shù)加以組合和應(yīng)用。
Anastassiadis通過擴(kuò)增谷氨酸棒桿菌和黃色短桿菌代謝關(guān)鍵酶、整合DNA染色體或插入編碼基因等來提高賴氨酸的產(chǎn)量[26]。Ohnishi等研究了谷氨酸棒桿菌產(chǎn)賴氨酸菌株和野生株的末端代謝途徑、碳源流向、代謝互鎖的相關(guān)基因。將野生株中的高絲氨酸脫氫酶和天冬氨酸激酶分別與丙氨酸突變株中的高絲氨酸脫氫酶和亮氨酸突變株中的天冬氨酸激酶等位互換,分別得到了產(chǎn)賴氨酸8和55 g·L-1的菌株;將以上兩個(gè)突變株在野生株中重新構(gòu)建,產(chǎn)賴氨酸75 g·L-1;將絲氨酸突變株中的丙酮酸羧化酶轉(zhuǎn)入到野生株中,僅發(fā)酵27 h就得到賴氨酸80 g·L-1[27]。
趙凱等以北京棒桿菌為研究對象,通過四輪基因組重排成功選育出了5株遺傳穩(wěn)定的高產(chǎn)賴氨酸菌株,其中1株重排菌株賴氨酸產(chǎn)量達(dá)到16.95 g·L-1,比原始菌株的賴氨酸產(chǎn)量提高了37.14%,比親本菌株賴氨酸產(chǎn)量提高了17.46%~31.19%[28]。
中國賴氨酸產(chǎn)業(yè)起步于20世紀(jì)90年代初,當(dāng)時(shí)賴氨酸總生產(chǎn)能力為每年1萬t。近年來,隨著我國賴氨酸產(chǎn)能量的高速增長,從2001年每年不足5萬t增長到2005年國內(nèi)賴氨酸總供給量約每年20萬t;2006年,賴氨酸產(chǎn)量已超過32萬t;2007年,國內(nèi)賴氨酸的總產(chǎn)量約每年40萬t,成為世界最大的賴氨酸生產(chǎn)國。
2006年,進(jìn)口賴氨酸的平均價(jià)格為13.30元·kg-1;2007年,國內(nèi)進(jìn)口賴氨酸的均價(jià)約14.30元·kg-1,同比上漲了約6.7%;國產(chǎn)賴氨酸均價(jià)約14.40元·kg-1,同比上漲約10%。雖然賴氨酸價(jià)格的漲幅較大,但生產(chǎn)廠家的利潤并未因此增加,其主要原因是原料成本和物流費(fèi)用的增加。隨著國產(chǎn)賴氨酸技術(shù)上的改進(jìn),產(chǎn)氨基酸優(yōu)良菌種的篩選和分子育種,通過不斷發(fā)掘新的菌種和改良現(xiàn)有的菌種,使產(chǎn)量增加、成本降低、質(zhì)量改善、功能增強(qiáng)、酶活性提高,徹底實(shí)現(xiàn)賴氨酸國產(chǎn)化。使用微生物發(fā)酵賴氨酸有方便、快捷和高效等特點(diǎn),具有廣泛的市場空間和經(jīng)濟(jì)前景。
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