酒石酸泰樂菌素聯(lián)合阿莫西林鈉縮小豬鏈球菌耐藥突變選擇窗的研究

劉 洋，徐 剛，王 敏，李洪濤，李艷華*

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030)

豬鏈球菌病是由多種溶血性鏈球菌(Streptococcus suis)引起的人獸共患的急性、熱性傳染病，呈世界范圍流行，給養(yǎng)豬業(yè)及公共衛(wèi)生構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅。目前，尚無(wú)理想的疫苗來預(yù)防該病，抗生素在預(yù)防和治療豬鏈球菌病中起著重要的作用。但由于大量和不合理的使用抗生素，S.suis的耐藥問題日益嚴(yán)重。因此，如何合理使用現(xiàn)有的抗菌藥物，減少和延緩細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生，就顯得十分重要。Zhao等首先提出了關(guān)于防細(xì)菌耐藥突變選擇濃度(Mutant prevention concentration，MPC)、突變選擇窗(Mutant selection window，MSW)的新假說和新理論，為臨床優(yōu)化抗菌藥物給藥方案，限制耐藥突變體選擇性擴(kuò)增提供了新思路[1]。MPC是指防止單次突變菌株被選擇性富集擴(kuò)增所需的最低抗菌藥物濃度。但是對(duì)某些器官來說，臨床上單獨(dú)應(yīng)用一種藥物時(shí)，要獲得血漿或組織藥物濃度超過MPC是很困難的，可能會(huì)引起宿主嚴(yán)重的毒性反應(yīng)，所以對(duì)不能使組織或血清藥物濃度超過MPC的藥物可以通過聯(lián)合用藥來防止細(xì)菌耐藥。酒石酸泰樂菌素(TLST)是一種大環(huán)內(nèi)酯類動(dòng)物專用抗生素[2]，為快效抑菌劑。阿莫西林(Amoxil)為β-內(nèi)酰胺青霉素類抗生素，由于其對(duì)細(xì)菌強(qiáng)效的抑制作用且低毒，是獸醫(yī)臨床主要的抗生素之一[3]，是細(xì)菌繁殖期殺菌劑。傳統(tǒng)的理論認(rèn)為，大環(huán)內(nèi)酯類抗生素和β-內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)合應(yīng)用產(chǎn)生拮抗作用。但近年來，臨床上將二者合用卻得到了較好的療效，也有不少報(bào)道認(rèn)為兩者合用治療重癥感染，特別是難治感染效果良好[4]。本試驗(yàn)通過測(cè)定TLST和Amoxil鈉各自單藥及二者聯(lián)合用藥對(duì)S.suis臨床分離株的MSW變化，在體外初步探討兩種不同作用機(jī)制的抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用是否可以縮小單藥對(duì)細(xì)菌的MSW，為臨床合理使用現(xiàn)有抗菌藥物，防止細(xì)菌耐藥產(chǎn)生提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株與病料 質(zhì)控菌株金黃色葡萄球菌ATCC 29213購(gòu)于中國(guó)獸藥監(jiān)察所。病料系2006年～2007年分別從東北三省各豬場(chǎng)通過滅菌棉拭子采集豬鼻腔分泌物。選取對(duì)TLST和Amoxil鈉均敏感的一株菌株，作為實(shí)驗(yàn)菌株，編號(hào)為D10分離株。

1.2 藥 物 TLST(含量：92.2%)原粉購(gòu)自西安亨通光華制藥有限公司。Amoxil鈉(含量：100%)原粉購(gòu)自浙江拓?fù)渌帢I(yè)有限公司。TLST、Amoxil鈉、復(fù)方TLST-Amoxil鈉分別配制成有效濃度為1024 μg/mL、1536 μg/mL、1024 μg/mL+1536 μg/mL(根據(jù)實(shí)驗(yàn)室棋盤微量稀釋法的結(jié)果，TLST和Amoxil鈉在2∶3時(shí)，對(duì)S.suis抗菌作用最好)，滅菌過濾，-20℃貯存。

1.3 最低抑菌濃度(MIC)測(cè)定 采用瓊脂平板二倍稀釋法：取S.suisD10分離株凍存菌株接種至腦心浸液瓊脂平板，37℃孵育過夜。取單個(gè)菌落接種于腦心浸液培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)。比濁法將菌液濃度先調(diào)整為0.5麥?zhǔn)瞎軕乙?1.5×108cfu/mL)，然后用腦心浸液培養(yǎng)基稀釋為約5×105cfu/mL。用倍比稀釋法分別配制含TLST溶液、Amoxil鈉溶液、TLST和Amoxil鈉混合液(2∶3)的瓊脂平板，濃度分別為0.05 μg/mL～38.4 μg/mL，19.2 μg/mL+12.8 μg/mL～0.0375 μg/mL+0.25 μg/mL。分別取 1.5×l05cfu/mL 菌液 100 μL接種于不同濃度的抗菌藥物平板上，37℃培養(yǎng)18 h～24 h后觀察結(jié)果，以平板上無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度定為MIC，并計(jì)算FIC。[注：FIC＝(聯(lián)合用藥時(shí)TLST的MIC/單獨(dú)應(yīng)用時(shí)TLST的MIC)+(聯(lián)合應(yīng)用時(shí) Amoxil鈉的 MIC/單獨(dú)應(yīng)用時(shí) Amoxil鈉的MIC)，F(xiàn)IC≤0.5，協(xié)同作用；0.5＜FIC≤1，相加作用；1＜FIC≤2.0，無(wú)關(guān)作用；FIC＞2.0，拮抗作用]。藥敏結(jié)果嚴(yán)格根據(jù)NCCLS標(biāo)準(zhǔn)[5]判讀。

1.4 MIC99測(cè)定 以抑制99%接種細(xì)菌生長(zhǎng)的最低抗菌藥物濃度為MIC99。采用瓊脂平板稀釋法測(cè)定MIC99。參照文獻(xiàn)[1]方法，以各藥MIC為基準(zhǔn)，線性遞減(10%)抗菌藥物濃度配制含藥瓊脂平板直至1/2 MIC。按照1.3方法進(jìn)行細(xì)菌富集，將菌液濃度先調(diào)整為3.0×108cfu/mL，再用肉湯10倍倍比稀釋至3.0×102cfu/mL。在每個(gè)含藥平皿及無(wú)藥平皿分別接種不同濃度菌液100 μL，37℃過夜培養(yǎng)，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算MIC99。

1.5 防突變濃度(MPC)測(cè)定 采用瓊脂平板稀釋法測(cè)定抗菌藥物對(duì)S.suisD10分離株的MPC。參照文獻(xiàn)[1]的方法，以各藥MIC為基準(zhǔn)，按照倍比稀釋遞增7個(gè)濃度，配制瓊脂平板。富集細(xì)菌，分別取3.0×l010cfu/mL菌液100 μL均勻涂抹在含有倍比稀釋的抗菌藥物瓊脂平板上，每個(gè)濃度4個(gè)平板，各平板細(xì)菌總接種量為1.2×l010cfu，通過菌落計(jì)數(shù)確保每個(gè)濃度平板的接種量＞l010cfu。37℃孵育，以72 h時(shí)無(wú)菌落生長(zhǎng)的最低藥物濃度稱為初測(cè)MPC(MPCpr)。以MPCpr為基準(zhǔn)，依次遞減(20%)抗菌藥物濃度重新配制含藥瓊脂平板，測(cè)定72 h時(shí)菌落生長(zhǎng)的最低藥物濃度定為MPC。對(duì)接近MPC的藥物濃度篩選出的菌株再接種于無(wú)藥平板上，傳代5次后，再接種于原篩選濃度的抗菌藥物平板上，確保所篩選出的菌株為耐藥突變株，凍存?zhèn)溆谩?/p>

重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)3次，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與討論

本實(shí)驗(yàn)通過瓊脂平板二倍稀釋法，分別測(cè)定了TLST、Amoxil鈉、復(fù)方TLST-Amoxil鈉對(duì)S.suisD10分離株的MIC、MIC99和MPC，結(jié)果見表1、表2。

表1 TLST、Amoxil鈉、TLST和Amoxil鈉聯(lián)合對(duì)S.suisD10分離株的MIC9及MIC99Table 1 MICand MIC99 of tylosin tartrate,Amoxicillin Sodium and tylosin tartrate combined with Amoxicillin Sodium forS.suisstrain D10isolate

表2 TLST、Amoxil鈉、TLST和Amoxil鈉聯(lián)合對(duì)S.suisD10分離株的MPC及MSWTable 2 MPC and MSW of tylosin tartrate,Amoxicillin Sodium and tylosin tartrate combined with Amoxicillin Sodium forS.suisstrin D10isolate

由表1和表2可看出，TLST素單藥的MIC為1.62μg/mL、Amoxil鈉單藥的MIC為0.56μg/mL、TLST和 Amoxil鈉聯(lián)用的 MIC 為 0.3 μg/mL 和 0.45 μg/mL，F(xiàn)IC指數(shù)為0.99，呈相加作用，這與本實(shí)驗(yàn)室的聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果一致。說明TLST和Amoxil鈉聯(lián)合應(yīng)用可降低兩藥單用對(duì)S.suisD10分離株的MIC及MIC99。TLST單藥的 MPC和 MSW 為 12.8 μg/mL和 9.71 μg/mL，Amoxil鈉單藥的 MPC和 MSW 為1.835 μg/mL 和 5.16 μg/mL，兩藥聯(lián)用的 MPC 和MSW 為 0.6144 μg/mL、0.9216 μg/mL 和 2.81 μg/mL，結(jié)果表明TLST和Amoxil鈉聯(lián)用可降低兩藥單用的MPC，并能縮小兩藥單用的耐藥突變窗，即聯(lián)用后可使TLST的耐藥突變窗縮小3.5倍、Amoxil鈉的耐藥突變窗縮小1.8倍。

MPC和MSW理論為有效抑制細(xì)菌耐藥及制定抗菌藥物應(yīng)用策略提供了新的思路和參考依據(jù)[7]。臨床可以采取縮小或關(guān)閉MSW的方法來抑制細(xì)菌耐藥[8]。但對(duì)大多數(shù)藥物來說，要獲得血漿或組織液藥物濃度超MPC是很困難的。當(dāng)兩種不同作用機(jī)制的抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用，細(xì)菌需要同時(shí)發(fā)生兩種耐藥突變才能生長(zhǎng)。因此，不同作用機(jī)制的藥物聯(lián)合應(yīng)用提供了一種關(guān)閉MSW的途徑,即使這些藥物各自都有非常高的MPC[9]。而本實(shí)驗(yàn)所研究的兩種抗菌藥物中，TLST和Amoxil這2種藥物作用機(jī)制各不相同，都是治療S.suis較為理想的藥物。

S.suis是否對(duì)TLST和Amoxil鈉發(fā)生了兩種耐藥突變，還需要進(jìn)一步的分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。綜上所述，TLST和Amoxil鈉聯(lián)合使用后，可以使S.suisMPC/MIC大大下降，說明TLST和Amoxil鈉復(fù)方制劑不僅可用于S.suis病的治療，而且可以降低彼此的耐藥突變選擇窗，延緩或降低S.suis耐藥性的產(chǎn)生。

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