豬圓環(huán)病毒2型感染對偽狂犬疫苗免疫應答的影響

司興奎，張濟培，陳建紅，顧萬軍，馬春全

(佛山科學技術學院 廣東省高校預防獸醫(yī)學重點實驗室，廣東佛山 528231)

自1991年Harding等首次報道豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)以來，該病已遍布全球[1]。隨后Clark等人證實PMWS同豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus，PCV)有關，序列比較結果顯示其不同于以往污染PK-15細胞的PCV1，因此，將與引起PMWS相關的 PCV命名為 PCV2[2-3]?，F(xiàn)已證實PCV2除被認為是PMWS的致病原外，該病毒感染還被認為與豬皮炎與腎病綜合征(PDNS)、仔豬的先天性陣顫(CT)及母豬繁殖障礙、仔豬腹瀉等疫病的發(fā)生有關，其中以PMWS危害最為嚴重[4]。已有研究表明PMWS病豬可表現(xiàn)出胸腺明顯萎縮甚至消失，免疫組織器官中并指狀細胞、濾泡間樹突狀細胞和淋巴細胞減少或衰竭，CD79α+B細胞主要依賴區(qū)域的淋巴濾泡界限模糊甚至消失，T細胞依賴的副皮質區(qū)細胞衰竭等免疫抑制性指征[5-6]。

中國作為世界養(yǎng)豬數(shù)量較多國家之一，PCV2感染和偽狂犬(Pseudorabies，PR)的發(fā)生均相當嚴重[7-11]。盡管PCV2感染情況較為普遍，但并非所有PCV2陽性豬均發(fā)展成為PMWS或PDNS，因此并未引起足夠的重視。豬PR作為困擾我國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重要疫病之一，盡管其基因缺失弱毒疫苗在絕大多數(shù)豬場廣泛使用，但仍時有PR發(fā)生。為探討PCV2感染是否影響機體對PR疫苗體液免疫應答，本實驗通過對單獨接種豬PR疫苗組及先進行PCV2感染3周后再接種豬PR疫苗組后不同時相血清中豬PR特異性抗體水平進行比較研究，為闡明PCV2感染對豬PR疫苗體液免疫應答的影響提供相關依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 PCV2 SX株由廣東省高校預防獸醫(yī)學重點實驗室分離保存；豬PRgE/gI雙基因缺失弱毒疫苗(Bartha-K61株)購自哈爾濱維科生物技術開發(fā)公司產品(200841)；豬PRV gB抗體阻斷ELISA診斷試劑盒購自瑞士IDEXX生物科技有限公司產品(09732-CD383)；pUC19DNA/MspⅠ(HpaⅡ)Marker購自MBI Fermentas生物技術有限公司產品；淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物制品科技公司產品；用于對外周血T細胞進行雙色分析的抗體包括：FITC標記鼠抗豬CD4單克隆抗體(MAb)和RPE標記的鼠抗豬CD8 MAb均購自美國Souther-Biotech有限公司。全自動血液分析儀(KX-21)為日本SYSMEX東亞公司產品；FACSCalibur流式細胞儀(FACS101)為美國BD公司產品；8頭29日齡健康皮特蘭杜洛克－長白雜交豬，購自廣東省惠州某豬場。

1.2 動物試驗 將8頭29日齡健康雜交豬隨機分為2組，嚴格進行隔離飼養(yǎng)，其中1組為單獨接種豬PR疫苗組(A組，n=3)、2組為PCV2感染3周后接種豬PR疫苗組(PA組，n=5)；PA試驗組仔豬在29日齡經鼻和口接種PCV2 SX株4 mL/頭(TCID50為107.25/0.3 mL)，A組及PA組試驗豬在50日齡時接種豬PR疫苗(試驗仔豬在3日齡已進行PR疫苗滴鼻免疫)，接種劑量均為2頭份/頭。各組均于接種疫苗前3周、1周(簡記為-3，-1)、接種疫苗時(簡記為0)及接種后1周、3周、5周、7周和9周(WPI)采取EDTA抗凝前腔靜脈血液，分別進行血液常規(guī)、流式細胞術分析及分離血清進行ELISA抗體檢測[6]。

1.3 PCV2基因組DNA的提取 參照文獻中的方法進行[12]。

1.4 檢測PCV2-ORF1的PCR方法的建立 根據(jù)GenBank中登錄的PCV2核酸序列，設計擴增ORF1片段的引物。引物序列為：5'-AGTGAGCGGGAAA ATGCAGA-3' 和 5'-TCCTCCGTGGATTGTTCTGT-3'。反應條件為：94℃3 min 1個循環(huán)；94℃30 s，57℃30 s，72℃30 s，35個循環(huán)；72℃10 min，反應結束。擴增產物大小為417 bp[12]。

1.5 白細胞和淋巴細胞含量的測定 采用全自動血液分析儀分別對白細胞、淋巴細胞含量進行檢測。

1.6 外周血單核細胞CD4/CD8雙色流式細胞術分析 利用流式細胞儀，在488 nm的氬激光波長下進行檢測，對外周血單核細胞通過門技術限定于淋巴細胞，分別對CD4+/CD8-、CD4-/CD8+及 CD4-/CD8+細胞亞群的相對含量進行檢測[6]。

1.7 數(shù)據(jù)表示方法 根據(jù)血常規(guī)分析的淋巴細胞的含量計算出 CD4+/CD8-、CD4-/CD8+及 CD4+/CD8+細胞亞群的絕對含量(以χ±SD表示)。

1.8 檢測豬PRV gB抗體的阻斷ELISA方法 按照試劑盒推薦快速模式的程序進行。結果判定方法為：S/N值不大于0.6的血清樣品判定為陽性，S/N值大于0.7的血清樣品判定為陰性，介于陰性和陽性血清阻斷值間的待檢樣品判定為可疑(以χ±SD表示)。

1.9 檢測PCV2抗體效價的間接ELISA方法 參照文獻[12]中的方法進行。

2 結果

2.1 臨床表現(xiàn)及血清中的病毒檢出情況 PA組在整個試驗過程中表現(xiàn)同對照組基本一致。隨機抽取3份感染組血清提取基因組DNA后，進行PCR檢測，結果見圖1。在0 WPI、5 WPI及9 WPI后均檢測到PCV2 ORF1陽性片段。

2.2 白細胞和淋巴細胞含量的測定結果 采用全自動血液分析儀對A組及PA組試驗豬的白細胞(簡稱為AW和PAW)、淋巴細胞含量(簡稱為AL和PAL)進行檢測。由圖2可見，在整個試驗過程中A組及PA組不同時相的白細胞含量無顯著差異，但在1WPI至3WPI期間即PCV2人工感染后4周至6周間，A組白細胞含量均高于PA組，此后除9WPI外(A組白細胞含量略高于PA組)，其余時相PA組白細胞含量甚至略高于A組，提示PCV2感染可導致白細胞含量的短時間下降，但隨后變恢復至正常水平。在整個試驗過程中除1 WPI和9 WPI外的所有時相PA組的淋巴細胞含量均略高于A組，提示PCV2感染對機體淋巴細胞含量并無明顯影響。

2.3 外周血單核細胞CD4/CD8雙色流式細胞術分析結果 采用CD4/CD8雙色流式細胞術可以區(qū)分CD4+/CD8-幼稚型Th細胞、CD4-/CD8+Tc細胞及CD4+/CD8+記憶/激活Th細胞亞群。對A組及PA組外周血單核細胞中各細胞亞群的含量的檢測結果(表 1)。除 3WPI時相 A組 CD4+/CD8-幼稚型 Th細胞含量略低于PA組外，在1WPI～7WPI過程中A組幼稚型Th細胞含量均高于PA組(分別簡稱為A4及PA4組)；而在-3WPI、-1WPI及9WPI時相，PA組幼稚型Th略低于PA組。從表1可見，在1WPI和9WPI時相，A組CD4-/CD8+Tc細胞含量高于PA組，特別是在9WPI，2者Tc細胞含量的差異顯著(p＜0.05)(分別簡稱為 A8及 PA8組)；除 1WPI和9WPI外，PA組的Tc細胞含量均高于A組，尤其在5WPI PA組Tc細胞含量為A組的1.76倍，但2組間無明顯差異。由表1可知，在整個試驗過程中，PA組CD4+、CD8+記憶/激活Th細胞含量均略高于A組(分別簡稱為A48及PA48組)。從PA組及A組Tc、記憶/激活Th、幼稚型Th的含量變化可推斷，PCV2感染后可使負責機體免疫回憶反應的記憶/激活Th細胞數(shù)量略有升高；PA組幼稚型Th細胞含量的下降表明，盡管幼稚型Th細胞未接觸過抗原，但是作為效應Th細胞的儲備細胞其數(shù)量的下降提示PCV2感染可以在一定程度上降低了機體T細胞和B細胞對抗原的識別功能；從總體上看，參與機體特異性細胞免疫的Tc細胞卻因PCV2的感染而得以升高，但在病毒感染后期(9WPI)Tc細胞數(shù)量顯著下降，提示病毒感染后期明顯抑制了機體特異性細胞免疫功能。

表1 A及PA組不同時相的CD4/CD8各淋巴細胞亞群的含量(×109個/L)Table 1 The CD4/CD8 subpopulation counts of lymphocytes of group A and PA at different weeks post inoculation(×109copies/L)

2.4 檢測豬PR抗體的阻斷ELISA方法 對A組及PA組試驗豬進行阻斷ELISA檢測相應的PR抗體水平(表2)。在整個試驗過程中，除9WPI外，A組的S/N值均低于PA組，提示PCV2感染對機體產生針對PRV gB特異性抗體有一定的抑制作用。另外，在人工PCV2感染前兩組的S/N值均符合陽性判定結果，此時并未接種PR弱毒疫苗，應歸結為母源抗體水平所導致，但隨后A和PA組抗體S/N值的差異進一步擴大，提示為PCV2感染所導致。

表2 A及PA組不同時相的PRV-gB抗體阻斷ELISA的S/N值Table 2 The S/N ratios of PRV-gB antibody of group A and PA by blocking ELISA

2.5 檢測豬PCV2抗體的阻斷ELISA方法 對PA組血清抗體檢測結果見表3。在0 WPI、5 WPI及9 WPI血清抗體P/N值均大于2，符合陽性判定結果。

3 討論

盡管PCV2是否為PMWS的唯一致病原尚存在爭議，但國外一些學者采用PCV2單獨感染息生或SPF豬已成功復制出PMWS，而且組織病理學和流式細胞術均證實機體出現(xiàn)淋巴細胞減少或衰竭及胸腺萎縮等不同程度的損害，提示PCV2可以引發(fā)機體發(fā)生免疫抑制或免疫妥協(xié)[4-6，13]。在本研究中盡管采用PCV2單獨感染健康豬未能復制出典型的PMWS臨床癥狀，但是通過對接種PR疫苗組和PCV2感染并接種PR疫苗組試驗豬血清中PRV gB特異性抗體水平進行比較，結果表明PCV2感染確實可以在一定程度上抑制機體對豬PR疫苗的體液免疫應答，而且在一定程度上影響機體T細胞和B細胞對抗原的識別功能功能，并在感染后期抑制了機體特異性細胞免疫功能，這也為生產亞臨床型PR的發(fā)生及豬PR疫苗免疫失敗提供了另外一種可能的解釋。

表3 血清樣品抗PCV2-ORF2抗體P/N均值和陽性率Table 3 Average P/N ratios and positive rates of antibodies for PCV2-ORF2 in sera of pigs after PCV2 infection

在中國，PCV2感染情況也相當普遍，部分省份和地區(qū)抗體或病毒核酸陽性率高達100%。而且隨著其它危害豬群的主要疫病不斷的得到控制，與PCV2相關疫病的危害正逐步凸現(xiàn)。據(jù)國外學者報道，某些病毒、疫苗或佐劑的免疫刺激可以促進PCV2感染豬發(fā)生PMWS，在我們的實驗中并未發(fā)現(xiàn)接種豬PR疫苗對加重PCV2感染的臨床癥狀方面的證據(jù)。

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