乙型腦炎病毒E蛋白Ⅰ、Ⅱ結構域抗原表位鑒定

閆麗萍，華榮虹，亓文寶，周艷君，李國新，于 海，姜一峰，田志軍，童光志*

(1.中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海200241；2.中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室/豬傳染病研究室，黑龍江哈爾濱150001；3.華南農業(yè)大學獸醫(yī)學院，廣東廣州510642)

流行性乙型腦炎(Japanese encephalitis，JE)，是由JE病毒(JEV)引起的一種人與動物共同感染的蚊媒病毒性疾病。JEV主要侵害人的中樞神經系統(tǒng)，引起急性病毒性腦炎，導致高病死率(25%)，或神經-精神后遺癥[1]；JEV感染豬可引起其繁殖障礙，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經濟損失[2]。JEV主要流行于亞洲[3-4]，在南半球亦有報道[5-6]。

E蛋白是JEV的主要結構蛋白，由500個氨基酸組成，它在病毒的吸附、融合、血凝、細胞趨向性、病毒毒力和誘導保護性免疫反應中起重要作用。Kolaskar等認為E蛋白的三維結構域Ⅲ(292 aa～402 aa)，集中許多抗原中和表位[7]。Seif等通過分段表達E蛋白，證明了中和表位存在于E373～399位的27個氨基酸序列內[8]。Wu等發(fā)現JEV的中和位點主要集中在 EⅢ的 E307～309、E327～333、E386～390這3個區(qū)域內[9]。本研究通過截短表達鑒定出 JEV EⅢ的線性抗原表位 E39(305～320)、E45-1(355～366)、E48-1(377～384)和 E49(385～400)，經體外病毒中和試驗表明，E39為具有病毒中和活性的抗原表位[10]。

為了進一步確定E蛋白的抗原表位，本研究設計了一組覆蓋E蛋白I、II結構區(qū)域的部分重疊短肽，基因合成后克隆于原核表達載體進行融合蛋白表達。通過對表達融合多肽進行western blot和ELISA反應性篩選，鑒定線性抗原表位為針對JE建立基于抗原表位水平的特異性診斷方法奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 質粒、陽性血清及實驗動物 質粒pGEX-6P-1、E.coliDH5α及BL21均為本實驗室保存。兔抗JEV SA14-14-2疫苗株陽性血清由第四軍醫(yī)大學馬文煜教授惠贈。BALB/c小鼠為中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物中心提供。

1.2 酶與標記物 限制性內切酶及T4 DNA連接酶均為TaRaKa公司產品；紅外熒光標記(IRDye700)的抗兔IgG抗體、紅外熒光標記(IRDye700)的抗鼠IgG抗體購自Rockland化學免疫試劑公司；IPTG、凝膠回收試劑盒為上海華舜生物工程有限公司產品。合成短肽由南京博亞生物有限公司合成。

1.3 短肽融合蛋白的設計 對E蛋白I、II結構區(qū)域(1 aa～296 aa)進行抗原表位作圖，設計了一套覆蓋全部E蛋白I、II結構區(qū)域的36個短肽E1～E36。這些短肽長為16 aa，部分重疊，各肽序列及位置如表1所示。并設計合成了36對寡核苷酸鏈。在編碼區(qū)的5'端引入BamH I位點，3'端引入XhoI位點。寡核苷酸由北京英駿生物技術有限公司合成。

1.4 短肽的融合表達與純化 pGEX-6P-1經BamH I、XhoI雙酶切回收后分別與退火的各雙鏈寡核苷酸連接，重組子經酶切鑒定后命名為pGEX-E1至pGEX-E36，由北京英駿生物技術有限公司測序驗證。將重組質粒轉化感受態(tài)大腸桿菌BL21，進行表達。將表達產物超聲波裂解后，12%SDS-PAGE檢測表達情況。可溶性短肽融合蛋白用谷胱甘肽Sepharose 4B RediPack親和層析柱(Pharmacia Biotech)純化，操作步驟按說明進行，純化后測定蛋白質含量。不溶性短肽融合蛋白經超聲波裂解后純化[11]。

表1 短肽序列與位置Table 1 The sequence and the location of designed short peptides

1.5 抗原表位進一步確定 根據實驗結果，將E10、E11進一步截短，設計系列短肽，如表2所示。具體步驟按1.4所述的方法進行。

表2 進一步確定的短肽序列與位置Table 2 The sequence and the location of deeply devided designed short peptides

1.6 抗融合蛋白血清的制備 融合蛋白的純化按1.4所述方法進行。首免用純化融合蛋白(濃度為1 mg/mL)與完全弗氏佐劑等體積混合乳化，腿部皮下注射免疫6周齡～8周齡雌性BALB/c小鼠5只(100 mg/只)，每隔2周用與不完全弗氏佐劑等體積乳化的純化融合蛋白加強免疫，第2次加強免疫后10 d采血分離血清，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 Western blot分析

1.7.1 檢測融合蛋白與JEV陽性血清的免疫反應性樣品經SDS-PAGE電泳后，轉移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂乳4℃封閉過夜，一抗為1∶100稀釋兔抗JEV SA14-14-2株陽性血清，二抗為1∶5000稀釋的紅外熒光標記的抗兔IgG抗體，具體試驗步驟按Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)說明書進行。

1.7.2 檢測鼠抗融合蛋白免疫血清 將純化的JEV樣品經SDS-PAGE電泳后，轉移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂乳4℃封閉過夜。一抗用1∶100稀釋的鼠抗融合蛋白免疫血清(該血清被過量的GST蛋白37℃孵育半小時)，其它步驟同1.7.1。

1.8 ELISA分析檢測

1.8.1 融合蛋白與陽性血清的免疫反應性 用0.1 mol/L碳酸鹽緩沖液(pH9.6)將純化的短肽融合蛋白按10 μg/mL的量包被ELISA板，4℃過夜，用1%BSA 37℃封閉3 h。以1∶100稀釋的 JEV陽性血清為一抗，37℃作用1 h，以1∶5000稀釋的HRP標記羊抗兔IgG抗體為二抗，37℃作用1 h，經TMB顯色液顯色15 min，讀取450 nm波長測量吸收值。[以P/N值≥2為陽性，P/N值＜2為陰性，P/N值=(檢測孔A值-空白對照孔A值)/(陰性鼠血清100倍稀釋A值-空白對照孔A值)]。

1.8.2 鼠抗融合蛋白血清與合成肽的免疫反應性用0.1 mol/L碳酸鹽緩沖液(pH9.6)將合成短肽按10 μg/mL的量包被ELISA板，一抗為倍比稀釋的鼠抗融合蛋白血清(1∶50～1∶800)，同時設非免疫鼠血清為陰性對照，二抗加入1∶5000稀釋的HRP標記羊抗鼠IgG抗體，具體試驗步驟按1.8.1的試驗方法進行。

2 結果

2.1 短肽融合蛋白的表達與純化 經SDS-PAGE分析表明，各短肽融合蛋白均得到了表達(圖略)。

2.2 短肽融合蛋白的western blot分析與ELISA檢測 Western blot和ELISA結果表明，表達的融合蛋白 GST-E1、GST-E10、GST-E11、GST-E19和 GSTE33能被JEV陽性血清所識別(圖1，圖2)。由于GST-E10，GST-E11是一個連續(xù)的氨基酸序列，為了確定抗原表位的主要功能性區(qū)域，將該段基因進一步截短表達，通過蛋白質印跡結果表明該區(qū)域含有2個抗原表位，即E10-4和E11-2(圖1)。

2.3 E蛋白1 aa～296 aa結構區(qū)域抗原表位作圖36個相互重疊且覆蓋E蛋白1 aa～296 aa的I、II結構區(qū)域的短肽融合蛋白經JEV陽性血清免疫印跡及ELISA篩選，以及通過免疫印跡進一步精確定位后，最終確定E1、E10-4、E11-2、E19和E335個線性抗原表位，表位作圖如下(圖3)。

2.4 融合短肽免疫原性分析 融合蛋白GST-E1、GST-E10、GST-E11、GST-E19和GST-E33經純化免疫小鼠制備了免疫血清，通過合成短肽包被ELISA板進行分析表明，這些融合短肽能誘導小鼠產生針對相應短肽的特異抗體，而且抗體滴度高于1∶200(圖4)，該結果表明所鑒定出的抗原表位均具有良好的免疫原性。而與全病毒的western blot結果表明，只有抗GST-E1，GST-E10，鼠血清能識別全病毒抗原(圖5)，分子量約為53 ku。

3 討論

3.1 E蛋白1 aa～296 aa區(qū)域的表位鑒定 本實驗采用原核表達系統(tǒng)對E蛋白I、II結構域1 aa～296 aa進行表位鑒定。通過免疫學反應性篩選，鑒定出5個線性抗原表位：E1(1 aa～16 aa)、E10-4(77 aa～84 aa)、E11-2(83 aa～94 aa)、E19(145 aa～160 aa)和 E33(257 aa～272 aa)。其中的 E11-2、E19和E33與1999年預測的表位E86～90、E153～158、E258～285及Kolaskar和Tongaonkar所預測的E88～95 相似[7，12]。而且，其中 E10(73 aa～88 aa)與Kutubuddin等報道的線性中和表位74 aa～87 aa重疊[13]；E19(145 aa～160 aa)表位包含E蛋白上唯一的糖基化位點，Dewasthaly等制備了一株抗表位E149 aa～163 aa具有中和活性的MAb[14]，該位點與本實驗鑒定的E19表位有12個氨基酸的重疊，E10和E19是否具有中和活性，還需進一步的實驗來證明。本實驗所確定的表位除E10和E19外，其它均是第一次通過實驗方法確定的。

3.2 抗原表位的免疫原性 融合蛋白GST-E1，GST-E10，GST-E11，GST-E19和GST-E33經純化免疫小鼠制備了免疫血清，通過合成短肽包被ELISA板進行分析表明，GST-E1誘導的免疫原性最強，其次是 GST-E10、GST-E11和 GST-E19，最弱的是GST-E33。這些融合短肽能誘導小鼠產生針對相應短肽的特異抗體，而且抗體滴度高于1∶200該結果表明所鑒定出的抗原表位均具有良好的免疫原性，為今后建立基于表位水平的特異性診斷JE試劑的研發(fā)奠定了基礎。

單因子血清與全病毒進行western blot分析，發(fā)現GST-E1和GST-E10制備的血清有反應性，而處于E蛋白中間的抗原表位融合蛋白GST-E11、GST-E19和GST-E33制備的血清沒有與全病毒反應。分析原因可能是由于E19(145 aa～160 aa)中包含E蛋白上唯一的糖基化位點和一個二硫鍵位點，E33(257 aa～272 aa)處有一個a-螺旋，E11(81 aa～96 aa)位于域П，由于原核表達蛋白不能進行正確的折疊以及糖基化修飾等蛋白質的后期加工，所以導致GST-E11、GST-E19和GST-E33制備的單因子血清沒有與全病毒反應。

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