牛型提純結(jié)核菌素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品的研制

關(guān)孚時(shí)，林朝洪，申詠紅，肖朝云，李 翠，戴志紅，張秀英，陸連壽，王在時(shí)

(1.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081；2.中牧實(shí)業(yè)股份有限公司成都藥械廠，四川成都610100)

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 已標(biāo)化的牛型PPD國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：2000，規(guī)格：3 mL/瓶)由本實(shí)驗(yàn)室制備，保存于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品(規(guī)格：58500 IU/1.8 mg)購(gòu)自英國(guó)NIBSC；體質(zhì)量約400 g白色健康豚鼠由中牧實(shí)業(yè)股份有限公司成都藥械廠提供；2歲齡健康西門塔爾肉牛由四川省成都市雙流縣鑫山牧業(yè)公司牛場(chǎng)提供。

1.2 候選物的制備 制備待檢牛PPD國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品樣品4批[4]，每批約2000 mL(濃縮原液)，無(wú)菌檢驗(yàn)合格后分裝于500 mL瓶中，置2℃～8℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 候選物的檢定篩選 待檢樣品的檢定包括純度測(cè)定和氮含量測(cè)定，根據(jù)檢定結(jié)果篩選適宜批次制備為待檢國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品。

1.3.1 純度測(cè)定 首先進(jìn)行多糖含量測(cè)定[5]，采用蒽酮法，用日立UV-3010紫外分光光度計(jì)于620 nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品和各個(gè)樣品的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖濃度與對(duì)應(yīng)OD值求回歸公式，計(jì)算樣品多糖含量；用紫外分光光度計(jì)于260nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定核酸標(biāo)準(zhǔn)品和各個(gè)樣品的OD值[5]，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)核酸濃度與對(duì)應(yīng)OD值求回歸公式計(jì)算樣品核酸含量。

1.3.2 氮含量測(cè)定 按文獻(xiàn)[4]的方法，采用凱氏定氮法[6]，使用福斯凱氏定氮儀2300型對(duì)候選物進(jìn)行氮含量測(cè)定，氮含量乘以6.25換算成蛋白質(zhì)含量。

1.4 待檢國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋、分裝、凍干

1.4.1 稀 釋 每支安瓿分裝蛋白質(zhì)含量1.8 mg，取待檢國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品濃縮原液730 mL、pH7.4 PBS 470 mL、苯酚6 g混合均勻，得到待檢國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品1200 mL。

同理，由典則反交換關(guān)系(2.5)可知， s=I-s也是L2(Γ,η)上的正交投影算子，且s與s相互正交。

1.4.2 分 裝 用瑞士進(jìn)口的Calibrex 520型數(shù)字式瓶端配液器(誤差范圍小于±1%)進(jìn)行分裝，每個(gè)安瓿分裝量為1 mL，共分裝待檢國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品1178支(瓶?jī)?nèi)留有殘余液體)。

1.4.3 凍 干 按照通常凍干曲線進(jìn)行，保證物理性狀和水分符合規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)。凍干后的待檢國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品保存在-30℃低溫冰箱，供以下試驗(yàn)使用。

1.5 待檢國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品的鑒定 待檢國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品的鑒定包括物理性狀檢驗(yàn)、無(wú)菌檢驗(yàn)、均勻性試驗(yàn)、效價(jià)測(cè)定、穩(wěn)定性試驗(yàn)(耐老化試驗(yàn))、特異性檢驗(yàn)、安全性檢驗(yàn)及協(xié)作標(biāo)定(另文發(fā)表)。

1.5.1 物理性狀檢驗(yàn) 按照文獻(xiàn)[4]方法進(jìn)行。

1.5.2 無(wú)菌檢驗(yàn) 按照文獻(xiàn)[4]方法進(jìn)行。

1.5.3 均質(zhì)性試驗(yàn) 取稀釋前的待檢國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品濃縮原液樣品3個(gè)，每個(gè)1.000 mL，分別進(jìn)行氮含量測(cè)定。同時(shí)取凍干后的待檢國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品15支，每支用1.000 mL生理鹽水溶解，取0.500 mL在相同條件下測(cè)定氮含量，分別計(jì)算稀釋前和凍干后變異系數(shù)。

1.5.4 效價(jià)測(cè)定 方法：參照文獻(xiàn)[3]和文獻(xiàn)[4]方法，將國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品和待檢國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋成蛋白質(zhì)含量為 100 IU/mL、50 IU/mL、25 IU/mL和12.5 IU/mL，分別相當(dāng)于蛋白質(zhì)含量0.00308 mg/mL、0.00154 mg/mL、0.00077 mg/mL和 0.00038 mg/mL。挑選8只致敏豚鼠，采用輪回?fù)Q點(diǎn)方式，在每只豚鼠拔毛處依次注射該8種菌素稀釋液，每點(diǎn)皮內(nèi)注射0.1 mL，24 h后，用游標(biāo)卡尺測(cè)量皮膚紅腫反應(yīng)面積。計(jì)算4個(gè)稀釋度國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品與待檢國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)面積的差值平均值，并根據(jù)兩者各自的4個(gè)稀釋度反應(yīng)面積平均值在同一個(gè)坐標(biāo)系內(nèi)作劑量反應(yīng)曲線。

1.5.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)(耐老化試驗(yàn)) 方法：取待檢國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品8支置50℃溫箱內(nèi)，每天記錄溫度，分別保存7 d、14 d、21 d和28 d。每個(gè)保存時(shí)間點(diǎn)取1支安瓿，用-30℃保存的待檢國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品作對(duì)照，均稀釋為0.00308 mg/mL(約100 IU/mL)，用5只豚鼠(要求和來(lái)源同效價(jià)測(cè)定)進(jìn)行效價(jià)測(cè)定，分別計(jì)算效價(jià)下降程度平均值。

1.5.6 特異性檢驗(yàn) 分別用健康易感牛和健康豚鼠進(jìn)行特異性檢驗(yàn)[3-4]。其中以牛進(jìn)行的特異性檢驗(yàn)用已標(biāo)化的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品做對(duì)照；以豚鼠進(jìn)行的特異性檢驗(yàn)用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品做對(duì)照。

1.5.7 安全性檢驗(yàn) 健康豚鼠2只，每只腹腔注射1 mg的待檢國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品，觀察其10 d內(nèi)是否健活。

1.5.8 協(xié)作標(biāo)定 擬安排有牛PPD檢驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)的企業(yè)進(jìn)行，由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所制定統(tǒng)一的協(xié)作標(biāo)定方案，用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品溯源標(biāo)定，實(shí)驗(yàn)完成后統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，最后確定待檢國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品國(guó)際單位含量。

2 結(jié)果

2.1 候選物的檢定篩選 制備的4批牛PPD國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品候選物的多糖、核酸及蛋白質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。200804批候選物蛋白質(zhì)含量適宜，而且多糖和核酸含量較少，因此將其制備為待檢國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品。

表1 候選物檢定結(jié)果Table 1 Chemical composition of the national standard candidates for PPD ofMycobacterium bovisTuberculin

2.2 物理性狀檢驗(yàn) 凍干的待檢國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品為乳白色疏松團(tuán)塊，加生理鹽水后在5 s內(nèi)溶解，符合《中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程》2000年版相關(guān)規(guī)定[4]。

2.3 無(wú)菌檢驗(yàn) 待檢國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品無(wú)菌檢驗(yàn)合格。

2.4 均勻性試驗(yàn) 稀釋前和凍干后的待檢國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品均勻性試驗(yàn)結(jié)果分別見(jiàn)表2、表3。結(jié)果表明稀釋前各樣品變異系數(shù)為1.4%，凍干后各樣品變異系數(shù)為4.8%。稀釋前和凍干后變異系數(shù)均小于5%，表明稀釋前和凍干后均勻性試驗(yàn)重復(fù)性均較好；凍干后變異系數(shù)比稀釋前的大，這說(shuō)明在稀釋、分裝、凍干、封口、開安瓿等過(guò)程中會(huì)引入一定的試驗(yàn)誤差，故在操作過(guò)程中，應(yīng)仔細(xì)把握每一個(gè)環(huán)節(jié)，盡量減少誤差。

表2 稀釋前均勻性測(cè)定結(jié)果Table 2 Homogenicity before dilution

2.5 效價(jià)測(cè)定 待檢國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果表明待檢國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品4個(gè)稀釋度引起的豚鼠皮膚紅腫面積與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)應(yīng)的稀釋度引起的皮膚紅腫面積的差值平均值在10%以內(nèi)，兩者的4個(gè)稀釋度的劑量反應(yīng)曲線基本平行(圖1)，即待檢國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià)與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品基本相同。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)(耐老化試驗(yàn)) 待檢國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。其結(jié)果表明待檢國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品50℃保存21 d之內(nèi)效價(jià)下降程度平均值小于10%，保存28 d效價(jià)下降程度平均值大于10%。

表3 凍干后均質(zhì)性測(cè)定結(jié)果Table 3 Homogenicity after lyophilization

表4 效價(jià)測(cè)定結(jié)果Table 4 The result of potency standardization

表5 穩(wěn)定性試驗(yàn)(耐老化試驗(yàn))結(jié)果Table 5 The result of stability test

2.7 特異性檢驗(yàn) 待檢國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)所有試驗(yàn)牛和豚鼠均不產(chǎn)生非特異性反應(yīng)。

2.8 安全性檢驗(yàn) 用于安全性檢驗(yàn)的豚鼠10 d內(nèi)健活，待檢國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品安全性合格。

3 討論

結(jié)核桿菌在液體培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)過(guò)程中除了產(chǎn)生較多的結(jié)核菌素蛋白外，還會(huì)產(chǎn)生一定量的多糖、核酸及殘?jiān)任镔|(zhì)，這些物質(zhì)含量過(guò)多會(huì)影響結(jié)核菌素蛋白的生物活性。對(duì)于牛PPD中多糖和核酸的含量，《中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程》2000年版[4]中沒(méi)有明確規(guī)定。但是作為待檢牛PPD國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品，必須了解其中多糖和核酸的含量。人醫(yī)使用的結(jié)核菌素純蛋白衍生物(TB-PPD)對(duì)多糖和核酸的含量規(guī)定為“每1 mg蛋白質(zhì)含多糖與核酸總量應(yīng)不高于0.1 mg”[5]，即多糖與核酸之和與蛋白質(zhì)的比例不高于10%。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果符合上述規(guī)定，表明整個(gè)測(cè)定方法正確，測(cè)定結(jié)果可靠，因此可以通過(guò)收集更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)制定出牛PPD產(chǎn)品的多糖和核酸含量標(biāo)準(zhǔn)。

氮含量測(cè)定是研制牛PPD國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品關(guān)鍵的一步，它直接關(guān)系到隨后的稀釋、分裝、凍干和鑒定工作。對(duì)牛PPD的氮含量測(cè)定，《中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程》2000年版規(guī)定的方法是凱氏定氮法，其原理是樣品中的含氮有機(jī)化合物與濃硫酸共熱消化，使蛋白質(zhì)分解。其中氨與硫酸化合生成硫酸銨，然后加堿蒸餾釋放出氨，氨用硼酸溶液吸收，再用硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定求出總氮量換算為蛋白質(zhì)含量[7]。傳統(tǒng)的凱氏定氮法操作比較繁瑣費(fèi)時(shí)，特別是蒸餾定氮過(guò)程的效率低，不利于大批樣品的測(cè)定[8]。因此人們對(duì)其不斷進(jìn)行改進(jìn)，在儀器裝置的系統(tǒng)化方面取得了不少進(jìn)展[9]。其中福斯自動(dòng)定氮儀應(yīng)用比較廣泛。本實(shí)驗(yàn)使用的福斯凱氏定氮儀2300型的工作范圍為0.1 mg～200 mg，滿足了微量定氮的試驗(yàn)要求。

1個(gè)國(guó)際單位(IU)是產(chǎn)生生物學(xué)反應(yīng)的最小單位。在本研究效價(jià)測(cè)定試驗(yàn)中，注射牛PPD的最小量為1.25 IU(或0.000038 mg)，國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品和待檢國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)面積的直徑都接近于能夠進(jìn)行有效判定的最低值(7 mm)[4]。結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)的待檢國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品前期定氮的準(zhǔn)確性較好。

雖然生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)定程序還沒(méi)有確定，但按照WHO的要求和國(guó)家一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范，應(yīng)包括本實(shí)驗(yàn)涉及的必要步驟和程序。其中穩(wěn)定性試驗(yàn)(耐老化試驗(yàn))結(jié)果不能充分說(shuō)明溫度與保存時(shí)間的關(guān)系，仍需要后續(xù)試驗(yàn)確定兩者之間的關(guān)系。

[1]李金嶺，郭宏軍，高明輝，等.歐盟皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)比較試驗(yàn)法結(jié)合ELISA檢測(cè)牛結(jié)核病的研究[J].中國(guó)動(dòng)物檢疫，2007，24(7)：28-29.

[2]劉思國(guó)，于輝，宮強(qiáng)，等.牛結(jié)核病研究進(jìn)展[J].畜牧獸醫(yī)科技信息，2003，(10)：10-14.

[3]世界動(dòng)物衛(wèi)生組織.陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)和疫苗手冊(cè)[S].農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)局/中國(guó)世界動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心譯，5版，北京：人民衛(wèi)生出版社，2007.

[4]農(nóng)業(yè)部獸用生物制品規(guī)程委員會(huì).中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000.

[5]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典.第3部[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005.

[6]中國(guó)獸藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)獸藥典.第1部[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000，附錄44.

[7]劉期成.試析食品中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定方法─凱氏定氮法[J].城市技術(shù)監(jiān)督，2000，(7)：47.

[8]何進(jìn)，梁運(yùn)祥.淺談凱氏定氮法[J].陜西糧油科技，1996，21(3)：52-53.

[9]黃曉東.凱氏定氮法的改進(jìn)及其發(fā)展趨勢(shì)[J].食品研究與開發(fā)，1996，17(2)：37-39.