我國部分地區(qū)牛支原體肺炎和關(guān)節(jié)炎的病原體診斷

冉智光，謝建華，駱 璐，楊澤林，凌洪權(quán)，蘇承忠，熊仲良，范偉興，米自由*

(1.重慶市動物疫病預防控制中心，重慶渝北401120；2.中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島266032)

2009年4月以來，重慶等省市從省外引進的肉用牛群發(fā)生以呼吸道癥狀為主的傳染病，主要表現(xiàn)為體溫升高(39℃～40.5℃)，咳嗽，氣喘，鼻流粘液性或粘液膿性分泌物，關(guān)節(jié)腫大，跛行或不能站立。氣管、支氣管內(nèi)有干酪樣分泌物或乳白色泡沫，胸腔、心包積液，纖維蛋白性滲出，胸肺、膈肺粘連，肺臟質(zhì)地變硬，表面有大小不等灰白(黃)色干酪樣或化膿性壞死灶，切面呈干酪狀，偶見白色膿腫。發(fā)病率20%～80%以上，死亡率5%～23.5%；在不治療的情況下，死亡率可達50%以上。我們進行了一系列實驗室檢測，診斷該病是以牛支原體(Mycoplasma bovis)感染為主引起的疾病?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料和方法

1.1 樣 品 采集自4個省市5個肉牛場表現(xiàn)較重呼吸道和關(guān)節(jié)炎癥狀病牛的肺、肝、脾、腎、淋巴結(jié)及滲出液等。

1.2 培養(yǎng)基 PPLO、血清肉湯、血清大豆胰酶肉湯、馬丁肉湯、營養(yǎng)平板、血清平板、血清TSB、鮮血平板、麥康凱、EMB、HE、DHL、SS、TSI等培養(yǎng)基分別購自BD公司和杭州天和公司的凍干粉，按說明書或常規(guī)方法配制而成。

1.3 病理組織學檢查 以多聚甲醛固定肺組織24 h～48 h，石蠟切片，H.E.染色，顯微鏡檢。

1.4 病料直接PCR檢測 將肺臟常規(guī)處理后，提取DNA，分別以絲狀支原體絲狀亞種[1]、牛支原體[2]、多殺性巴氏桿菌[3]、牛結(jié)核分枝桿菌[4]特異性引物進行PCR擴增。

1.5 細菌分離鑒定 取肺、肝、脾、腎、淋巴結(jié)及滲出液常規(guī)方法無菌接種各種增菌培養(yǎng)基、分離培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基于37℃自然空氣或5%CO2培養(yǎng)，挑純培養(yǎng)單菌落進行革蘭氏染色、鏡檢。

1.6 真菌分離培養(yǎng) 取病料無菌接種沙堡瓊脂平板37℃培養(yǎng)1 d～5 d，蘸取少量菌落與生理鹽水制成涂片，顯微鏡檢。

1.7 支原體分離鑒定 取肺等組織無菌接種以PPLO為基礎(chǔ)的支原體液體篩選培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基，37℃5%CO2培養(yǎng)3 d～5 d，每天觀察液體培養(yǎng)基的顏色變化，放大鏡或顯微鏡下觀察固體培養(yǎng)基上的菌落生長情況。對培養(yǎng)物以牛支原體特異性引物[2]和16S rRNA基因引物[5]進行PCR擴增，并進行序列測定和分析。

2 結(jié)果

2.1 病理組織學檢查結(jié)果 肺臟的組織學變化主要表現(xiàn)為間質(zhì)增生，肺泡間隔增寬和結(jié)構(gòu)破壞，細支氣管內(nèi)炎性滲出；干酪樣壞死灶內(nèi)含大量嗜酸性細胞碎屑，周圍淋巴細胞以及少量嗜中性粒細胞和單核細胞浸潤，結(jié)締組織增生形成纖維化(圖1)，呈卡他性支氣管炎、壞死性化膿性支氣管肺炎和纖維素性壞死性肺炎的特征。

2.2 PCR檢測結(jié)果 5個牛場的肺組織，僅有牛支原體特異性引物擴增出預期大小(1912 bp)的片段(圖2)；絲狀支原體絲狀亞種、多殺性巴氏桿菌和牛分枝桿菌特異性引物的擴增結(jié)果均為陰性。

2.3 細菌分離結(jié)果 從肺臟等組織中分離到大腸桿菌(E.coli)、沙門氏菌(Salmonella)、葡萄球菌(Streptococcus)、鏈球菌(Staphylococcus)(表1)，所有病料中均未分離到巴氏桿菌。

表1 細菌分離結(jié)果Table 1 The bacteria isolation from affected cattles

2.4 真菌分離結(jié)果 從1例肺臟分離到真菌，其菌落生長迅速，呈絨狀或絮狀，培養(yǎng)時間長后，中間呈暗煙綠色。挑培養(yǎng)物少許與生理鹽水制成涂片、鏡檢，可見大量球形孢子，分生孢子頭呈短柱狀。經(jīng)菌落特征和顯微形態(tài)比對判斷為煙曲霉。

2.5 支原體分離結(jié)果 肺組織無菌接種后96 h左右，液體培養(yǎng)基變黃，輕微渾濁；固體培養(yǎng)基長出細小菌落，顯微鏡下呈“煎蛋樣”(圖3)。3個分離株(Y1、T1、T3)16S rRNA全基因序列BLAST結(jié)果顯示與GenBank中登錄的牛支原體的同源性為99%～100%，與無乳支原體的同源性為98%～99%，與絲狀支原體的同源性只有81%左右，而3個分離株之間的同源性達到99.83%。將3個分離株16S rRNA全基因序列與部分常見支原體代表菌株作遺傳進化圖，結(jié)果(圖4)顯示與牛支原體代表株P(guān)G45親緣關(guān)系最近，與雞毒支原體最遠，與絲狀支原體代表菌株P(guān)G1和PG3位于兩個完全不同的分支上。16S rRNA全基因序列分析表明分離株不可能是絲狀支原體，應(yīng)為牛支原體或無乳支原體。以牛支原體特異性引物檢測，從4個分離株中都擴增到牛支原體oppD/F基因特異性片段，測序結(jié)果顯示與牛支原體的同源性達到99%以上，與無乳支原體的同源性接近或等于90%，結(jié)果證實所分離菌株為牛支原體。

3 討論

牛支原體于1961年從患乳房炎病牛中首次分離到[6]，可以引起牛的肺炎、關(guān)節(jié)炎、乳房炎、角膜結(jié)膜炎[7]。研究證明牛支原體是牛呼吸道疾病的主要病因，已成為歐洲和北美牛群中呼吸道疾病和多發(fā)性關(guān)節(jié)炎的重要病原，而且牛支原體感染后可明顯增加其他病原的繼發(fā)感染，對養(yǎng)牛業(yè)危害比較嚴重[2，7-8]。重慶等4省市5個發(fā)病牛群以肺炎和關(guān)節(jié)炎為主要臨床特點，其卡他性支氣管肺炎、壞死性化膿性支氣管炎和纖維素性壞死性肺炎組織學變化也與牛支原體肺炎基本一致[9-10]。從5個牛場病牛肺組織中均檢測到牛支原體特異性DNA片段；從4個場的病牛肺組織中都分離到支原體(1#場因肺組織嚴重腐敗而未分離到)。經(jīng)16S rRNA基因和oppD/F基因序列分析，從分子水平上鑒定分離株為牛支原體(M.bovis)。綜上所述，我們認為4省市5個牛場“疑似牛肺疫”的疫情主要是由牛支原體感染而引起的牛支原體肺炎，部分病牛同時伴隨關(guān)節(jié)炎，而并非絲狀支原體絲狀亞種(Mycoplasma mycoidessubsp.mycoides)所致的牛傳染性胸膜肺炎(牛肺疫)。長途運輸、饑渴、擁擠、混群、環(huán)境突變是幾起疫情發(fā)生的主要誘因，大腸桿菌、沙門氏菌、鏈球菌、葡萄球菌和真菌等繼發(fā)感產(chǎn)生了協(xié)同作用，進一步加重了病情，加之用藥不合理，導致較高的死亡率。

我國已于1996年宣布消滅了牛肺疫，由于牛支原體肺炎在臨床癥狀上與牛傳染性胸膜肺炎牛肺疫有相似之處，在基層診斷工作中可能引起誤解。因此對牛支原體實施及時和正確的診斷，對排除牛肺疫、并盡早得到OIE對我國無牛肺疫的認證具有十分重要的意義。在牛支原體肺炎和牛肺疫的診斷上，僅僅分離培養(yǎng)還不能將牛支原體與牛肺疫病原體(絲狀支原體絲狀亞種)以及無乳支原體區(qū)別開。目前最簡單、快速和準確的方法是PCR方法。16S rRNA基因在進化過程中相對保守，在細菌學分類上具有重要意義。針對16S rRNA基因的PCR可以將牛支原體與絲狀支原體區(qū)別開，但是牛支原體與無乳支原體曾同屬一個種，兩者親緣關(guān)系很近，16S rRNA基因同源性很高，即使測序可能區(qū)分不開。序列比較顯示編碼牛支原體和無乳支原體寡肽膜透酶(OPP)的基因差異較大。本研究使用牛支原體oppD/F基因特異性引物只能擴增出牛支原體的特異片段，不但可以與絲狀支原體絲狀亞種鑒別，也可以用于牛支原體與無乳支原體的鑒別[2]。

近年來，我國多個省市已出現(xiàn)類似病例，個別省已證實牛支原體肺炎的存在[5，11]。隨著我國奶業(yè)和肉牛產(chǎn)業(yè)的較快發(fā)展，牛群調(diào)運將會日益頻繁，該病傳播擴散的風險也將增高，應(yīng)引起各級獸醫(yī)部門的重視，提高對牛支原體肺炎的認識。該病的預防主要靠加強飼養(yǎng)管理，保證營養(yǎng)，做好日常保健，提高機體抵抗力，降低其它病原的感染機會，盡量減少長途運輸、極端天氣、擁擠、饑渴、混群等應(yīng)激因素或降低其造成的影響。該病發(fā)生后，在早期使用針對性藥物如泰樂菌素、土拉霉素、長效土霉素、林可霉素、泰妙菌素、氧氟沙星等抗生素，輔以黃芪多糖等免疫增強劑治療可以獲得較好的療效，但是使用劑量要足，并保證足夠的療程。

致謝：感謝辛九慶博士的支持和建議。

[1]辛九慶.牛傳染性胸膜肺炎診斷技術(shù)與分子流行病學研究[D].長春：吉林農(nóng)業(yè)大學，2007.

[2]Rifatbegovic M,Assuncao P,Poveda J B,et al.Isolation ofMycoplasma bovisfrom the respiratory tract of cattle in Bosnia and Herzegovina[J].Vet Rec,2007,160:484-485.

[3]Townsend K M,Frost A J,Lee C W,et al.Development of PCR assay for species and type-specific identification ofPasteurella multocidaisolates[J].J Clin Microbiol,1998,36(4):1096-1100.

[4]劉思國，王春來，宮強，等.牛分枝桿菌特異性PCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用[J].中國預防獸醫(yī)學報，2006，28(1)：80-83.

[5]辛九慶，李媛，郭丹，等.國內(nèi)首次從患肺炎牛肺臟中分離到牛支原體[J].中國預防獸醫(yī)學報，2008，30(9)：661-664.

[6]Hale H H,Helmboldt C F,Plastridge W N,et a1.Bovine mastitis caused byMycoplasma species[J].Cornell Vet,1962,52:582-591.

[7]Caswell J L,Archambault M.Mycoplasma bovispneumonia in cattle[J].Animal Health Res Rev,2008,8(2):161-186.

[8]Nicholas R A J,Ayling R D.Mycoplasma bovis:disease,diagnosis,and control[J].Vet Science,2003,74:105-112.

[9]Adegboye D S,Hailbur P G,Cavanaugh D L,et al.Immunohistochemical and pathological study ofMycoplasma bovis-associated lung abscesses in calves[J].J Vet Diagnostic Invest,1995,7:333-337.

[10]Radaelli E,Luini M,Loria G R,et al.Bacteriological,serological,pathological and immunohistochemical studies ofMycoplasma bovisrespiratory infection in veal calves and adult cattle at slaughter[J].Res Vet Science,2008,85:282-290.

[11]石磊，龔瑞，尹爭艷，等.肉牛傳染性牛支原體肺炎流行的診斷[J].華中農(nóng)業(yè)大學學報，2008，27(5)：629-633.