鴨副粘病毒人工感染鴨的病理組織學(xué)研究

張訓(xùn)海，王 玨，李升和，龔 爭，王 旋，鐘登科，胡元慶，張 偉

(家禽疫病防控監(jiān)測安徽省重點實驗室，安徽鳳陽233100)

副粘病毒科新增的禽腮腺炎病毒屬的代表種新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)是廣泛引起禽類嚴重致死性傳染病-新城疫(ND)的病原[1]，在血清型上屬禽副粘病毒(Avian paramyxovirus，APMV)血清1型(APMV-1)。NDV在世界上曾引起多次大流行，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大損失，至今仍是嚴重危害養(yǎng)禽業(yè)的主要疫病之一。OIE和我國將其與高致病性禽流感一樣，均列為I類或A類疫病。

早期研究發(fā)現(xiàn)，水禽對副粘病毒NDV具有較強的抵抗力，僅表現(xiàn)為健康帶毒，即使強毒感染也不致病[2]，極少有自然感染引發(fā)大批發(fā)病與死亡的報道[3]。但自上世紀末以來，在我國水禽飼養(yǎng)密集和水陸禽混養(yǎng)的地區(qū)，先后發(fā)現(xiàn)了可引起鵝、鴨高致病性感染與致死的NDV新致病型-鵝副粘病毒病[4-5]和鴨副粘病毒病[6]的流行，并引起了嚴重的經(jīng)濟損失。尤其是鴨副粘病毒病，除發(fā)現(xiàn)之初時的區(qū)域性普遍流行外，其后卻未見像鵝副粘病毒病那樣擴大蔓延與持續(xù)流行，而近年僅表現(xiàn)為零星散發(fā)的現(xiàn)象。

本研究以本實驗室曾首次報道的鴨副粘病毒W(wǎng)F00D株[6]進行家鴨的人工感染，在臨診和肉眼病理學(xué)檢查的基礎(chǔ)上，采集部分組織病料進一步進行顯微和亞顯微病理組織學(xué)檢查，旨在為鴨副粘病毒病流行規(guī)律的探究及致病機理的深入研究提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 鴨副粘病毒(WF00D株)為本室分離鑒定的保存株[6](第4代，HA：28；MDT為48.9 h；ICPI為1.80；IVPI為2.45)。1日齡健康建湖麻鴨購自安徽鳳陽縣某孵化場。飼料采用大北農(nóng)4%鴨料精配制的全價日糧。

1.2 人工感染 取隔離飼養(yǎng)至20日齡的健康建湖麻鴨120只，隨機均分為對照組和試驗組，并分別置于25℃隔離的環(huán)境中。試驗組鴨按0.5 mL/羽劑量皮下注射1∶5稀釋的SPF雞胚接種復(fù)壯的鴨副粘病毒；對照組僅皮下注射0.5 mL/羽滅菌生理鹽水。然后按常規(guī)進行消毒、飼養(yǎng)與觀察，并于接種后的第4 d、8 d、12 d、16 d和第20 d時，每組取鴨4羽迫殺，剖檢觀察其大體病變。

1.3 組織病理學(xué)標(biāo)本制備與觀察 立即解剖取心臟、腺胃、肝臟、小腸、脾臟、胸腺、肺臟、胰腺和腔上囊等器官，Bouin液固定，乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，徠卡切片機切片6 μm，HE染色，OLYMPUS-CH30顯微攝影系統(tǒng)顯微觀察并攝影。

1.4 電鏡材料制備與觀察 取上述各器官組織，切成約1 mm×1 mm×1 mm大小，2.5%戊二醛固定并修成0.5 mm 3左右的小塊，1%鋨酸后固定、梯度酒精脫水、環(huán)氧樹脂Epon812聚合和包埋，LKBV型超薄切片機切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，日本JEM-1200EX透射電鏡觀察和拍攝。超薄切片的制作與檢查，由南京軍區(qū)總醫(yī)院病理科完成。

2 結(jié)果

2.1 臨床和剖檢變化 與對照組鴨相比較，試驗組鴨在接種后的20 d觀察期內(nèi)，均未出現(xiàn)感染死亡病例，除部分精神稍有沉郁和腹瀉等外，其個體發(fā)育表現(xiàn)出日益明顯的差異，在試驗結(jié)束時，其體重和大小呈現(xiàn)出顯著的不均一性，少數(shù)相差達1倍～2倍。試驗組鴨的病變總體特征為：腺胃和小腸有輕微的炎性水腫、充血或出血現(xiàn)象；脾臟腫大明顯，質(zhì)地變脆；肝臟腫大呈土黃色；腎臟明顯腫大；胸腺、脾臟、肝臟、腎臟、心臟、肺臟等實質(zhì)性器官都表現(xiàn)為較嚴重的充血和出血現(xiàn)象。人工感染后各時期的剖檢病變詳述如下：

接種后第4 d時心臟點狀出血、腫大、質(zhì)地變軟，心包積液；脾臟腫大明顯；腺胃粘膜脫落、壞死，質(zhì)地變軟；胰腺腫脹、有針尖狀出血；氣管環(huán)有輕度出血；胸腺有針尖狀出血；肝臟邊緣略變鈍，有的呈淡灰色。

接種后第8 d時胸腺點狀出血；心包積液，心肌柔軟，心房腫大；肝臟土黃色、有出血斑并輕微腫脹；氣囊膜渾濁、有纖維樣附著物；腺胃分泌物增多、呈粘液樣；腎臟腫脹、出血；氣管針點狀出血；喉頭部分泌物增多、為濃稠樣。

接種后第12 d時胸腺點狀出血；心包積液，心臟出血明顯；肺部出血、漿膜增厚；腸粘膜出血；氣管點狀出血，分泌物增多；腎臟腫大、出血。

接種后第16 d時腹膜出血，氣囊有干酪樣滲出物；胸腺出血；肝臟腫大。

接種后第20 d時剖檢肉眼未見明顯病變。

2.2 顯微與亞顯微病理學(xué)變化 與同日齡對照組鴨比較，試驗組鴨各組織器官的病理組織學(xué)變化如下：心臟：第4 d時心肌出血；8 d～20 d心肌纖維腫脹，心肌纖維斷裂，周圍可見大量固縮的胞核和紅細胞(圖 1)。

肺臟：第4 d時呈漿液性肺炎，間質(zhì)淤血，炎性細胞浸潤，并見有三級支氣管出血(圖2)；第8 d時，間質(zhì)血管充血、出血，呼吸毛細管破裂，炎性細胞浸潤；第12 d時充血、淤血更加嚴重，間質(zhì)增厚，呼吸毛細管可見紅細胞；第16 d～20 d時呼吸毛細管破裂，并有充血和出血現(xiàn)象。

腎臟：第4 d時腎小管上皮細胞顆粒變性，管腔內(nèi)可見脫落的上皮細胞和炎性細胞，血管球充血；第8 d時腎小管上皮細胞腫脹、顆粒變性，間質(zhì)水腫，毛細血管擴張；有的血管球萎縮，腎小囊腔增大(圖3)；第12 d時腎臟間質(zhì)充血，腎小管上皮細胞腫脹、變性、壞死，血管球內(nèi)皮細胞腫脹；第16 d～20 d時，間質(zhì)仍有充血，有的腎小體血管球壞死、崩解，內(nèi)皮腫脹，腎小囊腔內(nèi)可見細胞碎片。

脾臟：第4 d時被膜下方可見大量紅細胞，紅髓充血現(xiàn)象明顯(圖4)，白髓粒細胞浸潤；第8 d時淋巴細胞有核固縮現(xiàn)象，橢球周邊細胞排列疏松，細胞間有較大空隙呈花形；第12 d時脾小結(jié)可見出血現(xiàn)象；第16 d和20 d時脾小結(jié)增多、增大，生發(fā)中心較為明顯。

電鏡下，第4 d時腎小管上皮細胞內(nèi)細胞器輕度變性，部分線粒體呈空泡狀(圖5)。第8 d時腎小管上皮細胞內(nèi)空泡狀線粒體明顯增多，腎小囊壁層細胞腫脹，細胞器變性(圖6)。第16 d時腎小管上皮細胞內(nèi)細胞器嚴重變性，胞漿局灶性溶解(圖7)。

胸腺：第4 d時部分胸腺小體崩解，形成碎片及圓形包囊，或溶解呈空泡狀，有的形成壞死灶(圖8)，第8 d和12 d時胸腺小葉髓質(zhì)仍有類似病變。第16 d和20 d時病變減輕。

腔上囊：第4 d時腔上囊小結(jié)髓質(zhì)漿液性滲出，有的小結(jié)萎縮，淋巴細胞變性壞死，結(jié)締組織增生；第12 d時腔上囊進一步退化，間質(zhì)增生、纖維滲出(圖 9)。

肝臟：第4 d時被膜下部分肝細胞呈空泡狀，電鏡下細胞器輕度變性(圖12)，中央靜脈擴張，肝血竇擴張、淤血；第8 d～12 d血竇里有大量血細胞，靠近被膜出現(xiàn)壞死灶，肝細胞嚴重脂肪變性(圖10)；第16 d～20 d肝細胞腫脹或萎縮，大小不一。第16 d時，電鏡下肝細胞嚴重變性，大量吞噬泡聚集，線粒體空泡化，胞漿局灶性壞死(圖13)。

胰腺：第4 d～20 d均可見炎性細胞浸潤，腺泡破裂。

腺胃：第4 d時腺集合竇壁內(nèi)炎性細胞浸潤或出血，腺細胞變性、壞死、脫落；第8 d～20 d上皮細胞壞死、脫落，集合竇內(nèi)有大量脫落的細胞碎片，固有膜水腫，出現(xiàn)壞死灶。

小腸：第4 d時黏膜上皮細胞變性、腫脹，固有膜水腫，有出血現(xiàn)象。電鏡下上皮和腸腺的細胞變性、溶解，線粒體空泡化，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒等現(xiàn)象明顯(圖14)。第8 d～20 d黏膜上皮細胞間可見炎性細胞浸潤，固有膜充血、出血，黏膜上皮壞死、脫落，腸腔內(nèi)有大量的脫落物(圖11)。

3 討論

本研究在進行鴨副粘病毒病首次鑒定時，將分離毒株(即WF00D株)回歸10日齡雛鴨，結(jié)果顯示，靜脈接種、肌注和滴鼻點眼途徑的雛鴨，發(fā)病率均為100%，而病死率分別100%、75%和50%，從出現(xiàn)發(fā)病癥狀到死亡的時間分別為2 d～5 d、3 d～5 d和4 d～7 d[6]。而用同期分離鑒定的雞源NDV(MDT為44 h；ICPI為1.74；IVPI為2.39)人工試驗感染16日齡的鴨，其發(fā)病率均為100%，病死率為0；靜注、肌注和滴鼻點眼途徑的病程分別為4 d～7 d、5 d～7 d和6 d～8 d[7]。本實驗以鴨副粘病毒W(wǎng)F00D株人工感染20日齡建湖麻鴨，除部分感染鴨精神稍有沉郁和個體發(fā)育差異顯著外，也均未出現(xiàn)感染致死病例，與自然發(fā)病鴨群的10%～50%死亡率[6]有一定差異。其原因除鴨品種因素外，可能是家鴨對該鴨副粘病毒病具有明顯的日齡抵抗力；同時，感染途徑也直接影響了感染的結(jié)局。如王宏偉等用企鵝源的新城疫強毒人工感染7日齡和14日齡北京雛鴨，結(jié)果只有靜脈接種才致雛鴨發(fā)病死亡，其致死率分別為100%和50%；而肌注和滴鼻點眼途徑均未表現(xiàn)任何異常[8]。此外，由于試驗鴨都是在恒溫控制的隔離環(huán)境下進行全價飼養(yǎng)，基本消除了飼養(yǎng)過程中的多種應(yīng)激影響，因而也進一步降低了試驗鴨群的感染易感性。

本實驗結(jié)果顯示，感染鴨的臨床癥狀不甚明顯，剖檢變化也較輕微，未出現(xiàn)感染死亡病例，與近年來的鴨副粘病毒病疫情趨于平穩(wěn)的現(xiàn)象相一致。但感染鴨在消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)卻都有明顯的病理組織學(xué)變化，而且其演變也有一定的規(guī)律性：組織病變在接種后的第4 d～16 d逐漸加劇，其中，第16 d時胸腺、腔上囊和脾等免疫器官及消化管病變減輕；第20 d時大部分器官組織病變逐漸開始好轉(zhuǎn)，但肝、腎、肺等器官的病變?nèi)暂^為嚴重。因此，通過與對照組相比較，筆者認為，感染病毒對鴨組織器官的這種持續(xù)性嚴重病理損傷，是導(dǎo)致感染鴨群體重和大小產(chǎn)生顯著性發(fā)育差異的根本原因。由此可見，在現(xiàn)行的開放或半開放生產(chǎn)模式與飼養(yǎng)條件下，由于各種諸如溫度、濕度、密度、營養(yǎng)等方面應(yīng)激因素的綜合作用下，鴨副粘病毒病零星散發(fā)的自然流行現(xiàn)象也是不難解釋的。這種以持續(xù)性病理組織學(xué)損傷和生長發(fā)育障礙為特征的“隱性感染”疫情，已取代高致病性鴨副粘病毒病[6]并成為該病的主要流行表現(xiàn)形式，這一新情況應(yīng)引起獸醫(yī)防疫部門的高度重視。

本研究結(jié)果和我們先前對鴨副粘病毒感染剖檢病理觀察的描述[5]，進一步充實和豐富了新城疫的病理學(xué)研究內(nèi)容。其與雞新城疫[2，7]和鵝副粘病毒病[9-11]在剖檢病變及病理組織學(xué)變化呈現(xiàn)出的差異性，如鴨副粘病毒對各組織器官的侵害程度及病理表現(xiàn)特征等的不同。至于這種差異是否與病毒的變異有關(guān)，還是與宿主有關(guān)[7，12]，有待后續(xù)的進一步研究。

[1]洪健，周雪平.ICTV第八次報告的最新病毒分類系統(tǒng)[J].中國病毒學(xué)，2006，21(1)：84-96.

[2]卡爾尼克(Calnek B.W)主編，高福，蘇敬良，主譯.禽病學(xué)[M].10版，北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1999，691-726.

[3]Higgins D A.Nine disease outbreaks associated with myxoviruses among ducks in HongKong[J].Trop Anim Health Prod,1971,3:232-240.

[4]辛朝安，任濤，羅開健，等.疑似鵝副粘病毒感染診斷初報[J].養(yǎng)禽與禽病防治，1997，1：5.

[5]王永坤，田慧芳，周繼宏，等.鵝副粘病毒病的研究[J].江蘇農(nóng)學(xué)院學(xué)報，1998，19(1)：59-62.

[6]張訓(xùn)海，朱鴻飛，陳溥言，等.鴨副粘病毒強毒株的分離和鑒定[J].中國動物檢疫，2001，18(10)：24-27.

[7]張訓(xùn)海，朱鴻飛，周功強，等.雞新城疫強毒株的分離及其人工感染試驗[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2002，24(3)：29-32.

[8]王宏偉，郭志儒，丁壯，等.企鵝新城疫強毒人工感染北京雛鴨的研究[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2000，22(3)：177-179.

[9]萬洪全，吳力力，許益民，等.鵝副粘病毒病的病理變化[J].中國獸醫(yī)學(xué)報，2000，20(2)：132-134.

[10]張潔，辛朝安，任濤，等.鵝的禽副粘病毒感染的病理學(xué)研究[J].動物醫(yī)學(xué)進展，1999，20(3)：170-173.

[11]周繼紅，田慧芳，王永坤，等.鵝副粘病毒的人工感染試驗[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，1999，21(1)：51-52.

[12]劉文博，萬洪全，吳艷濤，等.雞新城疫標(biāo)準(zhǔn)強毒感染鵝試驗[J].中國家禽，2001，23(19)：10-11.