傳染性胰腺壞死病毒VP3蛋白在干酪乳桿菌的表面表達(dá)

劉 敏，趙麗麗，葛俊偉，喬薪瑗，劉巍巍，趙永欣，李一經(jīng)

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱150030)

傳染性胰腺壞死病病毒(Infectious pancreas necrosis virus，IPNV)是引起鮭科魚類幼魚肝胰腺等內(nèi)臟實(shí)質(zhì)器官出血、壞死為特征的病毒性傳染病的病原。IPNV高致病力毒株對(duì)2月齡的幼魚致死率高達(dá)90%，感染后幸存的魚終生帶毒，通過糞便和精卵排出病原[1-2]，成為潛在的傳染源。國內(nèi)于1984年首次發(fā)現(xiàn)于西北地區(qū)某虹鱒養(yǎng)殖場(chǎng)，隨后國內(nèi)多家虹鱒養(yǎng)殖場(chǎng)先后暴發(fā)和流行。江育林等從患病的虹鱒(Oncorhynchus mykiss)體內(nèi)分離到病原，并鑒定為IPNV sp血清型[3-6]。因該病流行范圍廣，發(fā)病和致死率高，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來重大的經(jīng)濟(jì)損失。

IPNV屬于雙RNA病毒科(Birnaviridae)，水生雙RNA病毒屬(Aquabirnavirus)的代表種。病毒粒子為無囊膜的二十面體，直徑約60 nm[1]?；蚪M含有兩個(gè)雙鏈RNA節(jié)段被稱作A段和B段，B段(2777 bp)編碼一個(gè)較小的多肽VP1(94 ku)，VP1是病毒粒子依賴的RNA聚合酶(RdRp)，A段(3097 bp)內(nèi)含一個(gè)大的開放閱讀框架(ORF)，編碼由pVP2-VP4-VP3(106 ku)組成的多聚蛋白前體，在病毒成熟過程中，多聚蛋白前體再進(jìn)一步裂解成VP2(54 ku)和VP3(31 ku)蛋白[2，7-8]。其中 VP2 和 VP3 是 IPNV 主要的結(jié)構(gòu)蛋白，含有病毒主要抗原表位和中和抗原表位[2，9-10]。雖然大量研究已證明IPNV VP2蛋白是產(chǎn)生免疫保護(hù)的重要抗原，但是最新研究也表明，針對(duì)IPNV VP3蛋白的血清抗體，能夠在細(xì)胞水平上抑制病毒對(duì)細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，與VP2比較其免疫原性更強(qiáng)[11-12]。因此表明VP3蛋白亦含有重要的中和抗原表位。

目前對(duì)傳染性胰腺壞死還沒有特效治療藥物，主要以預(yù)防為主。歐州和美州地區(qū)的國家主要采取注射接種IPNV全病毒滅活疫苗預(yù)防傳染性胰腺壞死的發(fā)生，然而仍每年有30%～40%的孵化場(chǎng)暴發(fā)傳染性胰腺壞死，其中可能的原因是鮭鱒的幼魚和成魚在接種疫苗以前就感染了病毒[13]。理想的IPNV疫苗必須在稚魚期發(fā)揮長效的保護(hù)，防止其成為病毒攜帶者。但是注射免疫接種不適用于稚魚，因此口服和藥浴是魚類早期免疫接種的首選途徑。國內(nèi)目前對(duì)IPNV疫苗的相關(guān)研究還未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)將IPNV主要抗原VP3基因定向插入到乳酸桿菌表面表達(dá)型載體pPG1，以期獲得IPNV VP3蛋白錨定在菌體表面，為有效刺激機(jī)體免疫應(yīng)答產(chǎn)生免疫保護(hù)作用和潛在安全級(jí)重組活菌口服疫苗奠定重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株與質(zhì)粒 pMD18-T-VP3含有IPNV VP3(618 bp)基因序列，由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存；干酪乳桿菌表面表達(dá)載體pPG1，含有分泌信號(hào)肽基因序列(ssUSP)、氯霉素(Cm)抗性基因和錨定結(jié)構(gòu)序列(anchor)，Lactobacillus casei393由荷蘭NIZO研究所惠贈(zèng)；Lactobacillus casei393感受態(tài)細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室制備保存。

1.2 主要試劑 抗兔HRP-IgG、抗兔FITC-IgG購自Sigma公司，用前分別用0.10 mol pH7.2 PBS液稀釋成所需要的濃度；兔抗IPNV VP3蛋白高免血清由本實(shí)驗(yàn)室制備保存；質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒和柱式膠回收試劑盒購自上海華舜生物工程公司。

1.3 重組干酪乳桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 用質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒從大腸桿菌pMD18-T-VP3/JM109和含質(zhì)粒pPG1干酪乳桿菌Lactobacillus casei 393中提取重組質(zhì)粒pMD18-T-VP3及質(zhì)粒pPG1。將pPG1和pMD18-T-VP3分別進(jìn)行BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切后分別對(duì)目的片段用柱式膠回收試劑盒回收。將回收的pPG1和VP3的純化產(chǎn)物進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化于感受態(tài)細(xì)胞Lactobacillus casei 393，取適量菌液涂布于含有10 μg/mL氯霉素(Cm)的MRS瓊脂培養(yǎng)基上，37℃厭氧培養(yǎng)48 h～72 h，挑選菌落，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切和PCR鑒定陽性克隆，用于PCR鑒定的引物為P1(5'-AGCGGATCCT GCATCCGGGATGGACGAG-3')和P2(5'-AGCCTCGA GTCGTCGTTTCATCTGTC-3')。重組質(zhì)粒命名為pPG1-VP3，含陽性重組質(zhì)粒pPG1-VP3的干酪乳桿菌命名為pPG1-VP3/L.casei393。

1.4 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將pPG1-VP3/L.casei 393單個(gè)菌落接種5 mL MRS液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)使菌種活化，活化菌種按1∶20比例接種于10 mL含1%乳糖的MRS培養(yǎng)基中，30℃誘導(dǎo)16 h。

1.5 SDS-PAGE和western blot分析 分別取誘導(dǎo)前后樣品各1 mL以12000 r/min離心5 min，菌體用100 μL 10 mg/mL的溶菌酶，37℃水浴作用60 min，12000 r/min離心5 min，棄上清后，加入1×PBS和等量的2×SDS-PAGE樣品緩沖液(含DTT)，混勻，沸水浴5 min，12000 r/min離心5 min。取上清，12%SDS-PAGE，并轉(zhuǎn)印自硝酸纖維素膜上。兔抗IPNV VP3蛋白高免血清作為第一抗體，以辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG作為第二抗體，4-氯-1-萘酚底物顯色溶液中顯色15 min，觀察結(jié)果。

1.6 間接免疫熒光檢測(cè) 取經(jīng)誘導(dǎo)的重組干酪乳桿菌和含空質(zhì)粒的干酪乳桿菌各0.5 mL離心去上清后，分別用PBS洗菌體3次；加入兔抗IPNV VP3高免血清，混勻，37℃作用60 min，4000 r/min，離心5 min去上清，PBS離心洗菌體3次；加入稀釋的羊抗兔IgG/FITC熒光抗體，懸浮混合后37℃作用60 min，4000 r/min離心5 min去上清，PBS離心洗菌體3次；菌體沉淀物懸浮于200 μL PBS緩沖液中，取適量涂片，自然干燥后，預(yù)冷丙酮固定30 min后，熒光顯微鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 重組干酪乳桿菌表達(dá)質(zhì)粒pPG1-VP3的鑒定重組質(zhì)粒pPG1-VP3單酶切后得到大小約為4300 bp的基因片段，用BamH I、XhoI雙酶切后得到大小為618 bp和3700 bp基因片段，以P1、P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到約為620 bp基因片段,與預(yù)計(jì)大小相符合(圖1)。測(cè)序結(jié)果表明IPNV VP3基因片段已插入到表達(dá)載體pPG1中。

2.2 IPNV VP3蛋白在干酪乳桿菌中的表達(dá)與鑒定誘導(dǎo)后的菌體培養(yǎng)物經(jīng)SDS-PAGE和western blot分析，結(jié)果表明在SDS-PAGE凝膠上未發(fā)現(xiàn)有明顯的目的蛋白表達(dá)，但是轉(zhuǎn)印NC膜上，經(jīng)western blot檢測(cè)在其位置(31 ku)出現(xiàn)明顯的反應(yīng)帶(圖2)，說明目的蛋白在重組乳酸桿菌中獲得了表達(dá)，并且表達(dá)蛋白能被抗血清所識(shí)別。以重組干酪乳桿菌pPG1-VP3/L.casei393和pPG1/L.casei393所進(jìn)行的間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果表明，誘導(dǎo)的重組干酪乳桿菌pPG1-VP3/L.casei393經(jīng)熒光顯微鏡檢查可見明顯的黃綠色熒光(圖3a)，pPG1/L.casei393未出現(xiàn)熒光反應(yīng)(圖3b)。在間接免疫熒光試驗(yàn)中誘導(dǎo)后的重組菌體未經(jīng)任何處理，由此表明IPNV VP3蛋白在重組干酪乳桿菌表面獲得了表達(dá)。

3 討論

一般認(rèn)為VP3蛋白是作為IPNV的內(nèi)衣殼蛋白參與病毒粒子的組成[14]，但Tarrab等利用抗VP3單克隆抗體檢測(cè)到IPNV病毒粒子表面存在部分VP3蛋白[15-16]，Park等的研究表明，VP3蛋白含有重要的中和表位[11]。因此，由VP3基因編碼的蛋白和VP2蛋白一樣具有重要的免疫學(xué)功能。本實(shí)驗(yàn)利用具有錨定結(jié)構(gòu)的乳酸桿菌表達(dá)載體，構(gòu)建了表達(dá)IPNV VP3蛋白的重組干酪乳桿菌表達(dá)系統(tǒng)，SDSPAGE和western blot分析均表明，該蛋白獲得了正確表達(dá)，間接免疫熒光檢測(cè)表明，表達(dá)的重組蛋白錨定在菌體表面，從而為進(jìn)一步研究該蛋白的免疫活性及其相關(guān)功能奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。為達(dá)到VP3蛋白表達(dá)的目的，在未影響表達(dá)蛋白抗原性的前提下，去除了疏水氨基酸堿基序列，使IPNV VP3蛋白在乳酸菌中得以表達(dá)。

Petter等利用大腸桿菌表達(dá)了IPNV VP2蛋白進(jìn)行了免疫保護(hù)效果的測(cè)定，因表達(dá)蛋白在菌體內(nèi)部以包涵體形式存在，需超聲裂解后才能釋放所表達(dá)的蛋白，而且大腸桿菌自身的毒性作用注射虹鱒會(huì)有一定的毒副作用[17-19]。Thomas等將VP2和VP3基因在酵母中進(jìn)行了表達(dá)，表達(dá)后的蛋白需破碎酵母細(xì)胞壁后才能釋放出來[20]。本研究采用具有錨定結(jié)構(gòu)的乳酸菌表面表達(dá)載體，構(gòu)建了重組干酪乳桿菌活菌載體系統(tǒng)，所表達(dá)的蛋白錨定于干酪乳桿菌菌體表面，不需要任何后處理，可直接作為魚類的口服免疫制劑。利用活菌載體能夠完整地將抗原信息傳遞到腸道黏膜免疫系統(tǒng)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，同時(shí)乳酸菌本身就具有佐劑效應(yīng)、黏附特性、非特異性抑菌抗菌，抗腹瀉和腸道益生作用[21-22]。本項(xiàng)研究為防治魚類感染IPNV的安全級(jí)乳酸菌重組活菌疫苗奠定了重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。

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