雞馬立克病毒流行強(qiáng)毒株的致弱研究

劉愛(ài)玲，劉長(zhǎng)軍*，張艷萍，閆福海，2，張 鋒

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室禽傳染病研究室，哈爾濱150001；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱150030)

馬立克氏病(Marek's disease，MD)是由MD病毒(MDV)引起的雞的一種高度接觸性、傳染性腫瘤病。依據(jù)血清學(xué)特性將MDV分為3個(gè)血清型，致瘤性MDV屬于血清1型。MD可以通過(guò)疫苗免疫控制[1-2]。近年來(lái)，隨著MDV毒力的增強(qiáng)，其致病力亦呈增強(qiáng)趨勢(shì)，疫苗免疫失敗的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，因此，新的有效MD疫苗株的研究成為重點(diǎn)。由于與強(qiáng)毒株具有抗原相似性，血清1型的弱毒株將是更有效的疫苗。

我們從東北、四川2地區(qū)免疫發(fā)病雞場(chǎng)中分離獲得4株MDV流行毒株，選擇在雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)上連續(xù)傳代培養(yǎng)，獲得4株高代次細(xì)胞毒株。我們對(duì)L-SYp85C和L-MSp75C毒株的體外生長(zhǎng)特性、對(duì)無(wú)特定病原體(SPF)雞的致病性及羽髓中復(fù)制能力等進(jìn)行了動(dòng)態(tài)的研究。本研究為了解傳代毒株的弱化特性及弱毒疫苗株的篩選奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 病毒株和雞胚 分別命名為L(zhǎng)-SY、L-MS、LCZ、L-ZY的MDV 4株流行毒株為本實(shí)驗(yàn)室從東北、四川2地區(qū)免疫發(fā)病雞群采集病料分離獲得(表1)。SPF雛鴨、SPF雞胚、鴨胚由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

表1 實(shí)驗(yàn)用毒株Table 1 Strains used for the experiment

1.2 主要試劑 細(xì)胞培養(yǎng)用Medium199、犢牛血清購(gòu)自美國(guó)GIBCO生物公司；PCR反應(yīng)用試劑、Ex-Taq酶購(gòu)自TaKaRa生物工程公司。

1.3 病毒連續(xù)傳代培養(yǎng) 按常規(guī)方法用9日齡～10日齡SPF雞胚制備CEF。將4株MDV分離毒株L-SY、L-MS、L-CZ、L-ZY分別接種于CEF，37℃CO2培養(yǎng)至出現(xiàn)細(xì)胞病變(CPE)時(shí)，胰酶消化，適量接種到新鮮的CEF中，如此反復(fù)傳代培養(yǎng)至75代～85代，經(jīng)克隆純化，獲得4株高代次細(xì)胞毒株。

1.4 體外生長(zhǎng)曲線 通過(guò)測(cè)定相同接種劑量下不同生長(zhǎng)時(shí)間的病毒滴度和每百萬(wàn)感染細(xì)胞中病毒基因組拷貝數(shù)2種方法比較病毒在傳代過(guò)程中不同代次毒株增殖能力。選取L-SY毒株傳代過(guò)程中第9代、30代、45代、65代及85代細(xì)胞凍存毒種，以同一批次細(xì)胞測(cè)定病毒滴度。將病毒原液做10倍遞進(jìn)稀釋，以100 pfu劑量接種到單層CEF次代細(xì)胞的6孔培養(yǎng)板中，37℃CO2培養(yǎng)，在24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h時(shí)分別測(cè)定每個(gè)代次3個(gè)重復(fù)孔pfu數(shù)[3]。將病毒原液做10倍遞進(jìn)稀釋，以100 pfu劑量接種已長(zhǎng)成單層CEF次代細(xì)胞的6孔培養(yǎng)板中，37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h分別收獲每個(gè)代次病毒的3個(gè)重復(fù)孔，置于離心管中離心，PBS洗滌后再離心，消化，提取病毒基因組DNA，按照雙重?zé)晒舛縋CR(FQ-PCR)方法[3]測(cè)定每百萬(wàn)感染細(xì)胞中的病毒基因組拷貝數(shù)。

1.5 132 bpr拷貝數(shù)檢測(cè) 根據(jù)GenBank登錄的GA株全基因序列(AF147806)，采用Oligo6.0軟件設(shè)計(jì)132 bpr基因引物，用于擴(kuò)增4株分離毒株及其高代次細(xì)胞培養(yǎng)毒株、強(qiáng)毒J-1株和814疫苗株的132 bpr基因，引物由上海生物工程有限公司合成。上游引物序列：5'-TGCGATGAAAGTGCTATGG AGG-3'，在GA株基因組的位置為127553～127574；下游引物序列：5'-GAGAATCCCTATGAGAAAGCG C-3'；基因組中位置為 127848～127869。2拷貝PCR產(chǎn)物大小為314 bp，包含完整的132 bp重復(fù)序列。

PCR反應(yīng)體積為50 μL。反應(yīng)條件為：95℃5min；94℃30 s、56.5℃30 s、72℃45 s，25個(gè)～30個(gè)循環(huán)；PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)下觀察電泳條帶。

1.6 動(dòng)物攻毒試驗(yàn) 將1日齡SPF雛雞150只隨機(jī)分成5個(gè)組，每組30只，負(fù)壓隔離器中飼養(yǎng)至第12周。1組、2組雞腹腔接種L-SYp85C毒株和L-MSp75C毒株，接種劑量為2×104pfu/只，3組、4組雞腹腔接種L-SY毒株和L-MS毒株，接種劑量為2×103pfu/只，第5組雞為空白對(duì)照組，腹腔接種稀釋液。上述5組SPF雞分別于接種后的7 d、14 d、22 d、29 d、45 d對(duì)每組試驗(yàn)雞隨機(jī)選取3只稱重，剖檢病理變化，采取MD典型病變組織做病理組織學(xué)觀察，并采集3根～6根羽髓飽滿的羽毛。

1.7 AGP試驗(yàn) 試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，采集每組試驗(yàn)雞羽髓豐富的羽毛，取羽髓、剪碎，加少許PBS混勻，作為被撿抗原樣品，用MD陽(yáng)性血清檢測(cè)。

1.8 基因組的提取 細(xì)胞中病毒基因組的提取按常規(guī)方法進(jìn)行。羽髓中DNA的提取方法：將1根～2根羽毛中的羽髓取出剪碎，加入裂解液500 μL，55℃消化4 h～6 h，酚氯仿抽提，無(wú)水乙醇沉淀DNA，溶于適量的TE緩沖液中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.9 羽髓中病毒載量檢測(cè) 羽髓中病毒載量的測(cè)定：按1.7中方法提取的樣品DNA，通過(guò)測(cè)定同一樣品管中FAM和ROX熒光強(qiáng)度，推導(dǎo)出樣品DNA中MDV1基因組拷貝數(shù)和細(xì)胞拷貝數(shù)。數(shù)據(jù)采用MDV定量研究中常用的每百萬(wàn)細(xì)胞中病毒拷貝數(shù)(copies/106cell)的方法表示。

2 結(jié)果

2.1 分離毒株的傳代培養(yǎng) 4株分離毒株經(jīng)蝕斑純化后，選用CEF連續(xù)傳代至75代～85代，獲得了4株高代次細(xì)胞毒株(表2)。L-SYp85C和L-MSp75C株在CEF適應(yīng)性顯著提高，表現(xiàn)為形成時(shí)間縮短，蝕斑面積增大，病變細(xì)胞間出現(xiàn)明顯的融合現(xiàn)象。

表2 MDV毒株CEF傳代Table 2 MDV strains passaged in CEF

2.2 體外生長(zhǎng)曲線 L-SY毒株連續(xù)傳代至85代，選取傳代過(guò)程中第9代、30代、45代、65代及85代細(xì)胞凍存毒，通過(guò)測(cè)定不同生長(zhǎng)時(shí)間的病毒滴度及每百萬(wàn)感染細(xì)胞中病毒基因組拷貝數(shù)2種方法繪制病毒的體外生長(zhǎng)曲線。這2種檢測(cè)方法檢測(cè)對(duì)象有差異，生長(zhǎng)曲線也不同。對(duì)生長(zhǎng)過(guò)程中病毒滴度的檢測(cè)是對(duì)具有感染性的活病毒細(xì)胞進(jìn)行的檢測(cè)，可反映病毒的感染能力；而對(duì)每百萬(wàn)感染細(xì)胞中病毒基因組拷貝數(shù)的檢測(cè)則反映了全部的被感染細(xì)胞，而與病毒感染力不相關(guān)。2種方法繪制的L-SY毒株傳代過(guò)程中生長(zhǎng)曲線均表明，隨細(xì)胞傳代代次遞增生長(zhǎng)速度顯著增加(圖1，圖2)。

2.3 132 bpr基因拷貝數(shù)變異 132 bpr基因拷貝數(shù)增加被認(rèn)為是毒株弱化的一個(gè)特征性的變化[12]。132 bpr基因在毒力較強(qiáng)的毒株中一般以2拷貝或3拷貝的形式存在。4株MDV分離毒株的132 bpr基因經(jīng)PCR擴(kuò)增鑒定為2個(gè)拷貝，在CEF中連續(xù)傳代培養(yǎng)后獲得了4株高代次細(xì)胞毒株，其132 bpr基因拷貝數(shù)發(fā)生變異，凝膠電泳圖可見(jiàn)由2～7拷貝等形成的多拷貝混合體，最多可達(dá)到10個(gè)拷貝以上(圖 3)。

2.4 致病性試驗(yàn) 試驗(yàn)結(jié)束時(shí)將所有雞迫殺、剖檢，與對(duì)照雞比較分析。L-SY、L-MS毒株攻毒雞出現(xiàn)典型MD臨床癥狀，雞體瘦小，精神沉郁，羽毛粗亂等，并伴有早期的死亡。剖檢主要表現(xiàn)有不同程度的腺胃腫瘤、性腺腫瘤、肺臟腫瘤、心臟腫瘤等，灰白色，質(zhì)地堅(jiān)硬而緊密。L-SYp85C毒株攻毒雞剖檢僅有部分雞表現(xiàn)為性腺不同程度腫大和盲腸扁桃體出血等炎癥反應(yīng)。

表3 L-SYp85C、L-MSp75C毒株致病性試驗(yàn)Table 3 The experiment for pathogenicity of strain L-SYp85C and L-MSp75C

L-MSp75C毒株試驗(yàn)組和L-SYp75C毒株試驗(yàn)組體重平均值分別對(duì)照組比較分析，2組間總體平均數(shù)差異不顯著；但是L-MS、L-SY毒株試驗(yàn)組與對(duì)照組比較，差異顯著(p＜0.05)(表3)。

AGP試驗(yàn)檢測(cè)L-SY、L-MS毒株攻毒雞羽髓抗原，MD陽(yáng)性率為100%；L-MSp75C毒株和L-SYp75C毒株攻毒雞羽髓中AGP抗原檢測(cè)均為MD陰性。

2.5 病理組織學(xué)變化 L-SY和L-MS毒株攻毒雞病理組織學(xué)變化主要表現(xiàn)為卵巢內(nèi)卵泡萎縮，部分卵泡消失，間質(zhì)中伴有大面積彌散性淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)及曲細(xì)精管嚴(yán)重壞死崩解；腺胃粘膜上皮有脫落，腺管內(nèi)有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)灶，固有層內(nèi)有大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；法氏囊有部分濾泡內(nèi)細(xì)胞全部消失，濾泡呈大空泡狀，有的濾泡中心出現(xiàn)嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)灶等。L-SYp85C、L-MSp75C毒株感染的雞只大部分同空白對(duì)照組雞只相似，無(wú)病理組織學(xué)變化；少數(shù)雞表現(xiàn)為性腺曲細(xì)精管萎縮和部分壞死，盲腸扁桃體淋巴小結(jié)細(xì)胞內(nèi)的輕度減少和出血。

2.6 羽髓中病毒復(fù)制能力 通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，高代次細(xì)胞毒株L-SYp85C和L-MSp75C在整個(gè)檢測(cè)期間病毒載量均低于106copies/106cells，并且在接種21 d后病毒載量開(kāi)始下降，而L-SY和L-MS毒株感染14 d后，羽髓中病毒載量分別為106.8copies/106cells和 107.7copies/106cells，均在 106copies/106cells以上，并在14 d～21 d基本保持同一平臺(tái)。這說(shuō)明這2株傳代毒株在雞體內(nèi)的復(fù)制能力顯著降低。而2株傳代毒株在檢測(cè)的7 d～21 d病毒載量相對(duì)升高，推測(cè)是由高劑量病毒接種導(dǎo)致的結(jié)果。

3 討論

將MDV通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)連續(xù)傳代培育致弱疫苗已成功地應(yīng)用了40年。屬于血清Ⅰ型的HPRS-16att是第一株商品化的MDV疫苗，它是在雞腎細(xì)胞上傳代33代而致弱的。CVI 988是在鴨胚培養(yǎng)26代～35代致弱的。研究表明，MDV強(qiáng)毒株在細(xì)胞中連續(xù)傳代致弱所需要的代次既取決于分離毒株的毒力，也與繼代策略有關(guān)。GA/22、596A、617A等強(qiáng)毒株完全致弱需CEF繼代70代～80代，645、660A、686等超強(qiáng)毒株則需80代～120代才能達(dá)到完全致弱。MDV流行強(qiáng)毒株通過(guò)細(xì)胞連續(xù)傳代致弱獲得了許多疫苗候選毒株，如Md11/75或R2/23(Md11p106)等。

本實(shí)驗(yàn)選用的4株MD分離毒株是近年來(lái)本實(shí)驗(yàn)室從東北、四川2地區(qū)免疫發(fā)病雞群中采集病料分離獲得，其中L-SY、L-ZY株動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及L-SY、L-MS、L-CZ毒株羽髓中復(fù)制能力研究表明這4株毒株為流行強(qiáng)毒株[4-5]。4株分離毒株采用CEF連續(xù)傳代培養(yǎng)獲得了4株高代次細(xì)胞毒株。分離毒株體外連續(xù)傳代培養(yǎng)后，病毒生物學(xué)特性發(fā)生明顯變化，表現(xiàn)為生長(zhǎng)速度加快，病毒滴數(shù)提高。

病毒在細(xì)胞傳代培養(yǎng)后生長(zhǎng)速度的增加往往導(dǎo)致其在雞體內(nèi)的復(fù)制能力降低。我們的研究也證實(shí)傳代毒株具有體內(nèi)復(fù)制能力弱的特點(diǎn)。Baigent等通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明了羽髓中病毒載量的檢測(cè)是比較理想檢測(cè)材料，羽髓中病毒載量反映了病毒體內(nèi)的復(fù)制能力和毒株毒力[6-7]。Reddy和Yunis等通過(guò)定量感染雞的MDV1載量，得出MDV1早期復(fù)制率高其毒力強(qiáng)，MD發(fā)病率、死亡率高的結(jié)論[8-9]。我們將傳代獲得的分離毒株L-SYp85C、L-MSp75C毒株以親本毒株10倍劑量人工感染SPF雞，檢測(cè)其在7 d～45 d羽髓中的病毒載量發(fā)現(xiàn)，L-SYp85C、L-MSp75C毒株羽髓中病毒載量在整個(gè)檢測(cè)期內(nèi)均明顯低于親本毒株羽髓中病毒載量，既高代次毒株在羽髓中復(fù)制能力降低。而且病理組織學(xué)觀察和體重均值的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析也表明，這2株毒株經(jīng)傳代培養(yǎng)后毒力降低。弱毒疫苗株在雞體內(nèi)的復(fù)制能力與其對(duì)強(qiáng)毒攻擊的免疫保護(hù)能力密切相關(guān)。Gimeno等將一組具有高度免疫力的候選疫苗株與另一組保護(hù)力較差的候選疫苗株進(jìn)行了比較，他們發(fā)現(xiàn)，有高度保護(hù)力的疫苗株往往在體內(nèi)的復(fù)制能力較強(qiáng)，而且，能誘發(fā)雞的輔助性和細(xì)胞毒細(xì)胞的增殖[10-11]。因此，對(duì)MDV強(qiáng)、弱毒株羽髓中病毒載量檢測(cè)有助于了解病毒的體內(nèi)復(fù)制情況，判定毒株毒力，進(jìn)而為疫苗的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

此外，檢測(cè)132 bpr基因的拷貝數(shù)常作為判定毒株毒力的重要指標(biāo)。Becker等對(duì)不同毒力毒株132 bp重復(fù)區(qū)的鑒定說(shuō)明弱毒株通常具有CVI988類似的132 bp序列[12]。我們采用PCR方法擴(kuò)增4株高代次細(xì)胞毒株及其親本毒株、J-1株和814疫苗株的132 bpr基因，4株親本毒株132 bp重復(fù)區(qū)PCR鑒定均為2個(gè)拷貝，但傳代培養(yǎng)獲得的高代次細(xì)胞毒株其拷貝數(shù)明顯增加，可達(dá)到10個(gè)拷貝以上，符合弱毒株的特點(diǎn)。

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