靶向新城疫病毒NP基因的shRNA重組腺病毒表達載體的構建及鑒定

楊 帆，岳 華，侯 巍，湯 承

(西南民族大學生命科學與技術學院，四川成都610041)

RNA干涉(RNAi)是指雙鏈RNA(dsRNA)在細胞內(nèi)特異性地誘導與之同源互補的mRNA的降解,使相應基因沉默。研究發(fā)現(xiàn)，其基本作用方式是通過Dicer酶將dsRNA切割成2l nt～23 nt的小干擾RNA(siRNA)，siRNA與一種核蛋白體結合，形成RNA誘導的沉默復合體(RISC)，在ATP的參與下，siRNA解鏈，并引導RISC與其序列同源的mRNA結合，在核酸內(nèi)切酶的作用下，將靶mRNA切斷，從而阻斷基因表達[1]。大量的研究報告顯示RNAi已經(jīng)成為研究基因組功能的主要手段，并廣泛地應用于抗病毒治療的研究。如Huh-7細胞內(nèi)表達的發(fā)夾樣結構小干擾RNA(shRNA)能抑制乙型肝炎病毒的增殖[2]；慢病毒載體表達的shRNA能使HIV感染細胞的病毒基因表達量降低90%以上，抗病毒效應可持續(xù)35 d以上，能抵抗連續(xù)4次病毒的攻擊[3]。siRNA的轉染效率直接影響著干涉效果，脂質體等轉染試劑對原代細胞轉染效率低，是在其中進行RNAi研究的主要障礙。腺病毒載體以其高容量、感染細胞類型多、不會重組到宿主細胞的染色體組中、能夠長時間表達外源基因的優(yōu)點被廣泛應用于哺乳動物RNAi的研究[4]。本實驗室研究證明，表達靶向NDV NP基因的shRNA重組質粒能有效抑制NDV的增殖[5]，為進一步探討shRNA在活體中應用的可能性，本研究通過同源重組構建了表達siRNA分子的重組腺病毒，在雞胚成纖維細胞(CEF)和雞胚上評價了對雞新城疫病毒(NDV)增殖的干涉效果。

1 材料和方法

1.1 病毒株、載體和細胞 NDV F48E9株，購自中國獸藥監(jiān)察所；攜帶紅熒光蛋白(RFP)報告基因的shRNA重組質粒(pGenesil-3)由本實驗室構建，siRNA序列為AGGATGCCAACAAACCACT；腺病毒表達載體(pGSadeno)購自武漢晶賽公司；HEK 293細胞由南京農(nóng)業(yè)大學姜平教授惠贈；感受態(tài)細胞DH5α購自TaKaRa公司；雞SPF種蛋購自南京藥械廠。

1.2 主要試劑 T4 DNA Ligase、PI-SceI、I-CeuI、PacI內(nèi)切酶購自NEB公司；重組試劑購自Invitrogen公司；METAFECTENETM轉染試劑購自Biontex公司；質粒提取試劑盒購自Axygen公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購自Gibco公司。

1.3 shRNA質粒與pGSadeno載體重組 按照重組試劑說明書的方法將含有shRNA的pGenesil-3質粒與pGSadeno載體重組，重組產(chǎn)物轉化感受態(tài)細胞DH5α，挑取單菌落培養(yǎng)，提取重組質粒。用PISceI/I-CeuI雙酶切鑒定，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 重組腺病毒的包裝及效價測定 用PacⅠ酶切重組質粒制備線性化的DNA，依照METAFECTE NETM推薦程序，轉染HEK293細胞，24 h后觀察RFP報告基因的表達及細胞病變(CPE)。當細胞出現(xiàn)特異的紅熒光以及明顯的CPE，而且有超過50%細胞脫落時收取培養(yǎng)物，即為重組腺病毒(adv-RFP)。將Ade-RFP用DMEM 10倍遞增稀釋(10-1～10-7)，每個稀釋度取400 μL接種HEK293細胞單層的24孔板，每劑量設3孔重復?？瞻讓φ湛准尤?00 μL含10%小牛血清的DMEM， 37℃ 5%CO2培養(yǎng)24 h，在熒光顯微鏡下對RFP陽性細胞進行計數(shù)。按照下列公式計算病毒效價，病毒效價(pfu/mL)=RFP陽性細胞數(shù)×稀釋倍數(shù)/接種病毒的體積(mL)。

1.5 重組腺病毒的鑒定 用100 MOI adv-RFP感染CEF，4 h后接種100 TCID50的NDV作為干涉組，以等量pGSadeno空載體替代adv-RFP按上述方法處理CEF做為陰性對照，每組設3孔重復。NDV感染后6 h、9 h、12 h收取干涉組及陰性對照組的細胞和培養(yǎng)液，按照TRIzol試劑說明書提供的方法提取RNA，反轉錄為cDNA。參照文獻[5]方法檢測NDV NP基因mRNA的表達水平。以RPL4為內(nèi)參基因，使用本實驗室建立的雞RPL4熒光定量檢測方法，引物為P1:5'-TTATGCCATCTGTTCTGCC-3'；P2：5'-GCGATTCCTCATCTTACCCT-3'，反應體系 20 μL：SYBR Green I 10 μL、 ROX 0.4 μL、 P10.5 μL、P20.5 μL、cDNA 2 μL、ddH2O 6.6 μL。反應條件：95 ℃5 min；95℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 30 s，40個循環(huán)。用2-△△Ct方法對NDV NP基因進行相對定量[6]。

1.6 Ade-RFP對NDV增殖的影響 首先用50、100、150 MOI adv-RFP感染CEF，4 h后棄培養(yǎng)液，接種100 TCID50/孔的NDV，吸附30 min后加200 μL/孔的含5%小牛血清的DMEM維持液，將其作為干涉組，以等量pGSadeno空載體替代adv-RFP按上述方法處理CEF做為陰性對照，均設立3孔重復。37℃5%CO2培養(yǎng)。于Ade-RFP感染12 h、18 h、24 h、30 h、36 h觀察細胞的形態(tài)，并測定培養(yǎng)液中NDV的血凝價。選取13日齡SPF雞胚，通過靜脈注射接種0.2 mL Ade-RFP，同時絨毛尿囊腔接種NDV 0.2 mL，共接種9枚。按照同樣方法以pGSadeno替代Ade-RFP接種9枚做對照，置于孵化器培養(yǎng)，于接種后24 h、36 h、48 h觀察雞胚的活力，并取尿囊液測定NDV的血凝價。

2 結果

2.1 PI-SceI/I-CeuI雙酶切鑒定 重組腺病毒質粒經(jīng)PI-SceI/I-CeuI雙酶切后電泳出現(xiàn)1條約3 kb的目的條帶和1條大于15 kb的腺病毒載體條帶。

2.2 Ade-RFP效價測定 Ade-RFP感染HEK293細胞24 h后，10-5稀釋度3個重復孔的熒光細胞數(shù)平均為61個/孔，按照2.1.2中公式計算Ade-RFP的效價為3.05×107pfu/mL。

2.3 Ade-RFP感染CEF adv-RFP感染CEF 24 h后可通過倒置熒光顯微鏡觀察到紅熒光報告基因的表達，pGSadeno空載體對照組未出現(xiàn)特異的紅熒光(圖1)。說明adv-RFP能夠感染CEF，并且可將特異的shRNA遞送進CEF中。

2.4 Ade-RFP對NDV NP基因mRNA的表達效率檢測 熒光定量PCR檢測NP、RPL4基因的溶解曲線和擴增曲線如圖2。Ade-RFP在6 h、9 h、12 h顯著抑制了NDV NP基因mRNA的表達，與對照組中NP基因mRNA的水平相比，分別下降了3.2倍，25.6倍，2.57倍(圖3)。

2.5 adv-RFP對CPE的抑制作用 100 MOI adv-RFP能夠延緩CEF中CPE的出現(xiàn)，干涉組在NDV感染18 h后細胞形態(tài)規(guī)則，生長良好。對照組18 h時細胞圓縮并出現(xiàn)脫落，導致大小不等空斑的出現(xiàn)，貼壁細胞出現(xiàn)大小不一、形態(tài)各異的合胞體。24 h后干涉組少量細胞死亡，對照組細胞完全崩解。

2.6 Ade-RFP抑制NDV在CEF中的增殖 50 MOI adv-RFP對NDV的增殖影響不顯著，隨著adv-RFP用量的增加對NDV增殖抑制的作用逐漸增強。不同劑量的adv-RFP組在 12 h、18 h、24 h、30 h、36 h測得細胞培養(yǎng)液中NDV的血凝價見表1，從試驗結果可見，干涉組NDV的血凝價均比對照組低，而且差異顯著(p＜0.05)。

表1 adv-RFP在CEF上對NDV增殖的影響(血凝單位)Table 1 Inhibition of NDV replication in CEF by adv-RFP

2.7 Ade-RFP抑制了NDV在雞胚中的增殖 雞胚接種病毒后對照組于36 h死亡，干涉組雞胚的死亡時間比對照組晚12 h。36 h之內(nèi)adv-RFP對NDV在雞胚上的增殖具有抑制作用，24 h、36 h測得干涉組NDV的血凝單位均比對照組低，而且差異顯著(p＜0.05)，結果見表2。

表2 adv-RFP在雞胚上對NDV增殖的影響(血凝單位)Table 2 Inhibition of NDV replication in chicken embryo by adv-RFP(HA)

3 討論

研究表明，RNAi在抗病毒治療上已展現(xiàn)了巨大的潛力。RNAi已被證明能高效抑制病毒的復制，如應用RNAi在小鼠體內(nèi)抑制乙型肝炎的復制[7]；在人細胞系中抑制艾滋病病毒的復制[8]；抑制流感病毒的復制[9]；本實驗室構建的靶向NDV NP基因的shRNA質粒表達載體可以在CEF上顯著抑制NDV的增殖[10]。腺病毒載體已經(jīng)廣泛地應用于RNAi研究，如應用腺病毒載體介導的RNA干擾抑制口蹄疫病毒的復制研究[11]；腺病毒介導RNA干擾抑制血管內(nèi)皮生長因子的表達[12]。在CEF中應用腺病毒載體表達shRNA的RNA干涉研究未見報道。本實驗利用已經(jīng)構建的靶向NDV NP基因的shRNA質粒通過同源重組構建了表達靶向NDV NP基因shRNA的腺病毒，adv-RFP感染CEF 24 h后可在熒光顯微鏡下觀察到報告基因的表達，表明shRNA已被遞送到CEF中，而且熒光定量PCR檢測NDV NP基因顯示adv-RFP可顯著降低NP基因mRNA的表達，證明載體構建成功。

adv-RFP可推遲NDV感染CEF后CPE的出現(xiàn)；并且顯著降低了NDV NP基因mRNA的表達，從而抑制了NDV在CEF中的復制。血凝價檢測結果顯示干涉組血凝價低于陰性對照組，而且差異顯著(p ＜0.05)。

adv-RFP在CEF和雞胚中均可抑制NDV的增殖，與對照組比較能夠推遲雞胚死亡時間約12 h，為進一步在雞體中進行RNAi研究奠定了基礎。

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