生殖支原體粘附素蛋白MgPa的表達(dá)及其多克隆抗體的制備與純化①

曾焱華 吳移謀 游曉星 詹利生 粟盛梅 鄧紅玉

(南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所,衡陽421001)

生殖支原體(Mycoplasma genitalium,Mg)是1981年Tully等首次從2例非淋球菌性尿道炎(NGU)患者尿道分泌物中分離出的一種支原體[1]。研究表明,Mg可能引起泌尿生殖道感染,與盆腔炎、呼吸道感染、關(guān)節(jié)炎等疾病有關(guān),并可導(dǎo)致不育[2,3]。另外,Mg是HIV性傳播相關(guān)的機(jī)會(huì)感染病原體之一,被稱為AIDS相關(guān)支原體[4]。

Mg的細(xì)胞膜上含有較多的膜蛋白,其中由mgpB編碼的粘附素蛋白(MgPa)主要集中在Mg燒瓶狀的頂尖部位,對(duì)于Mg尖形結(jié)構(gòu)的形成和是否具有粘附性至關(guān)重要[5]。且體內(nèi)外研究表明,MgPa的C端具有很強(qiáng)的免疫原性(最強(qiáng)區(qū)位于第1 248～1 364 aa),能刺激感染的動(dòng)物模型和人類產(chǎn)生中和抗體[6,7]。因此,MgPa是一種重要的中和抗原,在Mg的診斷和預(yù)防中起著重要的作用。

由于MgPa基因與肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae,Mp)粘附蛋白P1基因具有較高的同源性[8]。我們前期的研究利用PCR擴(kuò)增了MgPa中與P1同源性極低且免疫原性較強(qiáng)的一段優(yōu)勢(shì)表位基因(MgPa,3 223～4 092 bp)并構(gòu)建了原核表達(dá)載體[9]。本研究利用原核表達(dá)載體在大腸桿菌中表達(dá)了MgPa的重組蛋白(rMgPa′),重組蛋白經(jīng)鑒定與純化后免疫家兔獲得了免疫血清,采取飽和硫酸銨法和親和層析法對(duì)免疫血清進(jìn)行純化得到了較高純度的抗rMgPa′的多克隆抗體,為進(jìn)一步探討其生物學(xué)功能及其在Mg的臨床診斷與預(yù)防方面的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 PET-30a(+)/MgPa′原核表達(dá)載體為本研究所前期制備并保存;小鼠抗His抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物公司,辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠和羊抗兔IgG抗體均為美國(guó)Jackson ImmunoResearch Laboratories公司產(chǎn)品;BCA微量蛋白測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京百泰克生物公司;硝酸纖維素膜和ECL發(fā)光試劑為英國(guó)Amersham公司產(chǎn)品;弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑均為Sigma公司產(chǎn)品。實(shí)驗(yàn)用新西蘭白兔由南華大學(xué)動(dòng)物部提供。Ni-NAT瓊脂糖純化介質(zhì)購(gòu)自Qiagen公司。溴化氰活化的瓊脂糖4B為GEHealthcare公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要儀器 凝膠電泳成像分析儀購(gòu)自珠海黑馬公司。半干轉(zhuǎn)印儀為美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 用終濃度為1.0 mmol/L的IPTG分別誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化有重組載體pET-30a(+)/Mg-Pa′的表達(dá)宿主菌 E.coli RosettaTM2(DE3)1、2、3 和 4小時(shí),同時(shí)設(shè)空菌組、空質(zhì)粒組和未誘導(dǎo)組做對(duì)照。離心收集菌體沉淀,用SDSbuffer煮沸5分鐘后進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.3 重組蛋白的親和層析純化與包涵體的復(fù)性 包涵體的洗滌和溶解參照文獻(xiàn)[10]進(jìn)行,溶解后的包涵體經(jīng)14 000 r/min離心30分鐘,收集上清液并緩慢過Ni-NAT親和層析柱,隨后以洗滌液洗柱,收集洗脫液,進(jìn)行SDS-PAGE分析后合并含洗脫蛋白質(zhì)的組分,即為純化的 rMgPa′。純化的 rMgPa′依次用透析 液(50 mmol/L Tris、0.5 mmol/L EDTA 、50 mmol/L NaCl、0.2 mmol/L DTT 、1 mmol/L GSH、0.1 mmol/LGSSG、20%～50%甘油、pH8.35)于4℃透析3次,每次8小時(shí),經(jīng)13 000 r/min離心15分鐘,收集上清液,用BCA微量蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。

1.4 重組蛋白的鑒定 取誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物加入到2×SDS上樣緩沖液中,于 100℃煮沸 10分鐘,經(jīng)12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后用半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,經(jīng)5%脫脂牛奶4℃封閉過夜,依次滴加 1∶500抗6×His抗體,室溫孵育 2小時(shí),經(jīng)洗膜后與1∶5 000 HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG孵育1小時(shí),洗膜后用ECL發(fā)光試劑顯色。

1.5 兔抗rMgPa′抗體的制備 取經(jīng)純化復(fù)性并定量的rMgPa′與完全弗氏佐劑一起研磨成乳狀,皮下多點(diǎn)注射于新西蘭兔背部,免疫劑量每只兔為200 μg。三周后每隔14天用rMgPa′200μg加弗氏不完全佐劑加強(qiáng)免疫3次,同時(shí)做陰性對(duì)照組(未注射組)。每次免疫前均以耳緣靜脈采血,末次免疫14天后心臟處死采血,分離血清,保存于-20℃待用。

1.6 多克隆抗體的純化 按參考文獻(xiàn)[11]的方法利用飽和硫酸銨法初步純化血清,然后再用溴化氰活化的瓊脂糖4B做親和層析。其步驟簡(jiǎn)述如下:用1 mol/LHCl溶解并洗滌1克溴化氰活化的瓊脂糖4B凍干粉劑,用偶聯(lián)緩沖液(0.1 mol/L NaHCO3,0.5 mol/L NaCl,pH8.3)將其與重組蛋白混合于4℃偶聯(lián)過夜,洗滌后轉(zhuǎn)入阻斷緩沖液(0.1 mol/L Tris-HCl,pH8.0)以封阻殘留活性基團(tuán)。

再依次用偶聯(lián)緩沖液和乙酸鹽緩沖液(0.1 mol/L NaAc,0.5 mol/L NaCl,pH4.0)循環(huán)洗滌偶聯(lián)介質(zhì)4次。將已與蛋白偶聯(lián)的瓊脂糖裝入層析柱內(nèi) ,以0.2mol/L pH 9.0NaHCO3(含0.1mol/LNaCl)洗滌至洗出液的OD280＜0.02,緩慢加入待純化的經(jīng)初步提純的多克隆抗體,用0.01 mol/L pH7.4 PBS液洗脫至洗出液OD280＜0.02。緩慢加入0.1 mol/L pH2.4甘氨酸-HCl緩沖液,收集解吸附下來的成分,立即以1 mol/LNaHCO3中和,以免蛋白變性。解吸附下來的蛋白用等量的2×SDS上樣緩沖液煮沸10分鐘后進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.7 多克隆抗體的鑒定 純化的rMgPa′經(jīng)12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后用半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,經(jīng)脫脂牛奶封閉后,用純化的兔抗rMgPa′多克隆抗體(1∶4 000)室溫孵育 2小時(shí),洗膜后與HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶5 000)孵育1小時(shí)。經(jīng)洗膜后用ECL發(fā)光試劑顯色。

1.8 間接ELISA檢測(cè)特異性抗體 用純化的rMgPa′包被微孔板,將待測(cè)血清(預(yù)先用空菌的裂解液混合過夜以吸附非特異性的抗體,10 000 r/min離心取上清)加入微孔板內(nèi)并進(jìn)行倍比稀釋,37℃溫育2小時(shí)后洗板 5次,加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶4 000),37℃溫育1小時(shí)后洗板,加顯色底物避光顯色10分鐘,加終止液終止反應(yīng),用酶標(biāo)儀測(cè)定A450值,以正常組兔血清做陰性對(duì)照,結(jié)果以待測(cè)標(biāo)本A450值/陰性對(duì)照A450值≥2.1為陽性,以出現(xiàn)陽性反應(yīng)的最高稀釋度作為血清的效價(jià)。

2 結(jié)果

2.1 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 用1.0 mmol/L IPTG分別誘導(dǎo)重組質(zhì)粒 1、2、3、4小時(shí),經(jīng)超聲裂解菌體后分別取上清和沉淀樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析。結(jié)果顯示,成功表達(dá)出一分子量約為37 kD的目的蛋白,以誘導(dǎo)3～4小時(shí)時(shí)表達(dá)量最多,目的蛋白主要以包涵體形式存在(圖1)。

圖1 SDS-PAGE分析 rMgPa′的表達(dá)Fig.1 Expression of r MgPa′was analyzed by SDS-PAGE

圖2 SDS-PAGE分析純化的 rMgPa′Fig.2 Purified rMgPa′was analyzed by SDS-PAGE

2.2 重組蛋白的純化 將蛋白變性液過Ni-NAT親和層析柱純化,SDS-PAGE分析的結(jié)果顯示為一分子量約37 kD的單一清晰條帶(圖2),表明成功純化出目的蛋白,用BCA微量蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定所得到蛋白的濃度達(dá)1.16 mg/ml。

2.3 重組蛋白的Western blot鑒定 Western blot的結(jié)果表明:誘導(dǎo)產(chǎn)物在目的位置出現(xiàn)特異性條帶,而未誘導(dǎo)產(chǎn)物則未出現(xiàn)特異性條帶(圖3),說明表達(dá)的蛋白為與6×His融合的目的蛋白。

2.4 多克隆抗體的純化 IgG抗體在煮沸和SDSPAGE條件下被2-巰基乙醇還原,使其降解成重鏈(H鏈)和輕鏈(L鏈)2個(gè)亞單位,由圖4可知:其重鏈分子量約為50 kD,輕鏈分子量約為25 kD,因此,所制備的IgG抗體的分子量約為150 kD。

圖 3 Western blot鑒定 rMgPa′Fig.3 r MgPa′was identificated by Western blot

圖4 SDS-PAGE分析純化的兔抗r MgPa′IgG抗體Fig.4 Purified rabbit anti-rMgPa′IgG antibody was analyzed by SDS-PAGE

圖5 Western blot鑒定r MgPa′抗體的特異性Fig.5 Identification of the specificity of anti-r MgPa′antibody by SDS-PAGE

2.5 兔抗rMgPa′多克隆抗體的特異性鑒定 Western blot結(jié)果表明:對(duì)于誘導(dǎo)的重組菌表達(dá)產(chǎn)物和經(jīng)純化的rMgPa′蛋白,在37 kD處均出現(xiàn)單一特異性條帶(圖5),而未誘導(dǎo)的重組菌裂解物未出現(xiàn)特異性條帶,表明所制備的抗 rMgPa′抗體能與rMgPa′發(fā)生特異性結(jié)合。

2.6 ELISA檢測(cè)免疫血清特異性抗體 間接ELISA的結(jié)果表明,用rMgPa′免疫新西蘭兔后,隨著免疫時(shí)間的延長(zhǎng),其血清中抗rMgPa′抗體效價(jià)逐漸升高,免疫第4次后抗體效價(jià)達(dá)到最高,其抗體效價(jià)為1∶25 600,對(duì)照組兔經(jīng)PBS加福氏佐劑免疫4次后,血清中未檢出特異性抗體。

3 討論

研究表明,在Mg的細(xì)胞膜上含有較多的膜蛋白,這些膜蛋白通過?；^定在細(xì)胞膜上,是介導(dǎo)Mg粘附到宿主細(xì)胞表面的物質(zhì)基礎(chǔ),因而與其致病性有關(guān);另外,由于Mg的膜蛋白位于支原體的膜表面,能與周圍環(huán)境不斷相互作用因而影響機(jī)體的免疫系統(tǒng)[12]。在Mg的膜蛋白中,含量最多且對(duì)粘附起關(guān)鍵作用的是MgPa。編碼MgPa的基因由含有mg190(mgpA)、mg191(mgpB)和 mg192(mgpC)三個(gè)基因的操縱子所組成[13]。編碼MgPa的基因一半是重復(fù)拷貝,且與Mp粘附蛋白P1基因同源,兩者的氨基酸同源性達(dá)51.7%[8]。

本研究所前期的研究利用Expasy應(yīng)用軟件對(duì)MgPa編碼基因進(jìn)行分析,通過PCR擴(kuò)增出MgPa中與Mp P1蛋白同源性極低且免疫原性較強(qiáng)的一段優(yōu)勢(shì)表位基因(MgPa,3 223～4 092 bp),并成功構(gòu)建了原核細(xì)胞表達(dá)載體PET-30a(+)/MgPa′。由于所選定的目的基因存在大量對(duì)于大腸桿菌而言屬于稀有密碼子的堿基,稀有密碼子對(duì)應(yīng)的tRNA豐度低,有可能在翻譯過程中發(fā)生終止和移碼突變,影響目的基因的表達(dá)。因此,本研究中應(yīng)用了能夠提供稀有密碼子tRNA的表達(dá)宿主菌 E.coli RosettaTM2(DE3),以避免因大腸桿菌稀有密碼子使用頻率導(dǎo)致的表達(dá)限制,從而使原核細(xì)胞表達(dá)載體EPT-30a(+)/MgPa′得到了高效表達(dá)。但是在大腸桿菌中表達(dá)的目的蛋白經(jīng)常發(fā)生錯(cuò)誤的折疊,并聚集成為包涵體[14]。本研究中所表達(dá)的目的蛋白大部分是以包涵體形式存在。蛋白的體外復(fù)性曾被認(rèn)為是一項(xiàng)異常艱巨的任務(wù)。由于對(duì)蛋白折疊和它的反應(yīng)機(jī)理的了解,使復(fù)雜蛋白的復(fù)性成為可能,我們通過對(duì)包涵體的變性和復(fù)性處理,最終獲得了可溶性的目的蛋白。

本研究中選擇的表達(dá)載體pET-30a(+)含有6個(gè)組氨酸的編碼序列,可使表達(dá)的外源重組蛋白帶上6個(gè)組氨酸的純化標(biāo)簽,且不影響重組蛋白的結(jié)構(gòu)和功能,但是通過組氨酸與金屬離子(Ni2+)的鰲合作用,有利于表達(dá)蛋白的純化。本研究中利用Ni2+-NAT親和層析柱成功純化出較高純度的rMgPa′,以純化的rMgPa′免疫新西蘭兔,成功制備了其相應(yīng)的抗體,經(jīng)間接ELISA法測(cè)定其特異性IgG抗體的效價(jià)高達(dá)1∶25 600,說明表達(dá)的重組蛋白具有良好的免疫原性,能刺激新西蘭兔產(chǎn)生特異性抗體。

飽和硫酸銨鹽析法是抗體分離純化中最常用的技術(shù)之一,具有溶解度大、分離效果好、對(duì)抗體有穩(wěn)定結(jié)構(gòu)等優(yōu)點(diǎn)。本研究采用飽和硫酸銨法沉淀蛋白,以去除血清中大量的纖維蛋白、白蛋白等雜蛋白對(duì)血清進(jìn)行初步純化。然后將重組蛋白與溴化氰活化的瓊脂糖偶聯(lián)制備了親和層析柱,對(duì)抗體進(jìn)行了進(jìn)一步純化,經(jīng)SDS-PAGE分析的結(jié)果表明,所純化的抗體顯示出兩條帶,其重鏈約為50 kD,輕鏈約為25 kD,因此,其 IgG抗體的分子量約為 150 kD。Western blot的結(jié)果說明制備的抗體具有高度的特異性,能特異性識(shí)別表達(dá)的重組蛋白。因此,本研究的結(jié)果為進(jìn)一步研究MgPa的功能及其在Mg診斷和預(yù)防方面的應(yīng)用奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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