HMGB1對(duì)HTLV-1病毒Tax蛋白表達(dá)的T細(xì)胞中NF-κB活性的影響①

劉蘇慧 牛志國 李俊英 胡新攀 趙玲玲 范勇利 陳麗媛 王 輝

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系,新鄉(xiāng)453003)

高遷移率組蛋白B1(high mobility group box-1,HMGB1)是一種存在于真核生物細(xì)胞內(nèi)的非組蛋白染色體結(jié)合蛋白[1],許多研究證實(shí)HMGB1作為一種炎癥介質(zhì)和致炎細(xì)胞因子,是啟動(dòng)和維持炎癥級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)的中心分子,與多種腫瘤、關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病、多器官功能障礙綜合征等發(fā)病機(jī)制關(guān)系密切,已成為近年危重醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一[2]。而Tax蛋白是由成人T淋巴細(xì)胞1型病毒(human T-cell lymphotropic virus type1,HTLV1)的tax基因編碼,在成人T淋巴細(xì)胞白血病(adult T-cell leukemia,ATL)發(fā)病早期起關(guān)鍵作用,研究已經(jīng)表明Tax蛋白可以促進(jìn)NF-κB的持續(xù)活化最終導(dǎo)致HTLV-1型病毒感染細(xì)胞最終發(fā)展為ATL細(xì)胞,這可能是ATL發(fā)病的主要機(jī)制[3]。為了研究作為重要炎癥因子的HMGB1是不是與ATL的發(fā)病相關(guān),為此我們準(zhǔn)備構(gòu)建HMGB1的真核表達(dá)載體并研究其與Tax及NF-κB之間的關(guān)系,以期為ATL的發(fā)病甚至臨床檢測治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞系與質(zhì)粒 人CD4+T淋巴細(xì)胞系Jurkat E6-1細(xì)胞系購自美國ATCC公司;大腸桿菌DH5α由本室保存;TaxN及TaxP細(xì)胞系為本研究中心建立[4];pNF-κB-luc報(bào)告基因質(zhì)粒為美國NIH欒好江博士惠贈(zèng);pcDNA3.0空質(zhì)粒為新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院千新來教授惠贈(zèng)。pCMV-βGal質(zhì)粒購自Promega公司。

1.1.2 主要試劑 熒光素報(bào)告基因檢測試劑盒、βGal檢測試劑盒購自 Promega公司;Trizol試劑、Taq酶、DNA MarkerⅠ和Ⅲ、質(zhì)粒提取試劑盒均購自北京天根公司;反轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)、T4連接酶、各種限制性內(nèi)切酶均購自TaKaRa公司;PCR及DNA回收純化試劑盒、質(zhì)粒DNA提取純化試劑盒、凝膠回收試劑盒、ECL發(fā)光試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)有限公司;兔抗人HMGB1、p65、GAPDH 抗體及HRP標(biāo)記羊抗兔二抗均購自碧云天生物公司;所用引物(見表1)均為上海英駿生物公司合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人HMGB1真核表達(dá)載體的構(gòu)建 Trizol試劑提取生長狀態(tài)良好的Jurkat E6-1細(xì)胞總RNA,RTPCR擴(kuò)增HMGB1的開放性閱讀框全長片段,退火溫度58℃;HindⅢ和EcoRⅠ雙酶切后純化的HMGB1片段與pcDNA3.0雙酶切產(chǎn)物連接,16℃過夜后轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α。挑取陽性菌落增菌,菌液PCR(退火58℃)篩選,提取質(zhì)粒雙酶切,同時(shí)送上海英駿生物公司測序。

1.2.2 RT-PCR檢測HMGB1、p65及Tax基因mRNA的表達(dá) 將pcDNA3.0-HMGB1轉(zhuǎn)染TaxN細(xì)胞(TNH組)和TaxP細(xì)胞(TPH組),對(duì)照組TaxN細(xì)胞(TaxN組)和TaxP細(xì)胞(TaxP組)轉(zhuǎn)染pcDNA3.0空質(zhì)粒,質(zhì)粒均為0.5μg,轉(zhuǎn)染方法詳見文獻(xiàn)[4],培養(yǎng)48小時(shí)后提取細(xì)胞的總RNA,RT-PCR檢測HMGB1、p65、Tax及GAPDH的 mRNA的表達(dá),退火 HMGB1為58℃,p65為57℃,Tax為56℃。電泳圖片用 Band leader 3.0進(jìn)行灰度分析,以目的片段條帶灰度值與GAPDH灰度值的比值反應(yīng)目的基因的表達(dá)量。

1.2.3 Western blot檢測HMGB1及p65蛋白的表達(dá) 將pcDNA3.0-HMGB1轉(zhuǎn)染TaxN細(xì)胞(TNH組)和TaxP細(xì)胞(TPH組),對(duì)照組TaxN細(xì)胞(TaxN組)和TaxP細(xì)胞(TaxP組)轉(zhuǎn)染pcDNA3.0空質(zhì)粒,質(zhì)粒均為0.5μg,轉(zhuǎn)染方法詳見文獻(xiàn)[4],培養(yǎng)48小時(shí)后提蛋白,Western blot檢測HMGB1蛋白及p65蛋白表達(dá) ,一抗均 1∶1 000稀釋,4℃過夜,二抗 1∶600 稀釋,室溫孵育1.5小時(shí),ECL發(fā)光。所得膠片經(jīng)掃描后用Quantity one4.6.2進(jìn)行分析,以目的片段條帶灰度值與GAPDH灰度值的比值反映目的基因的表達(dá)量。

1.2.4 熒光素酶檢測NF-κB活性 陽性組將pcDNA3.0-HMGB1和pNF-κB-luc共轉(zhuǎn)染TaxN和TaxP細(xì)胞,陰性組共轉(zhuǎn)染 pcDNA3.0和pNF-κB-luc質(zhì)粒,以TaxN細(xì)胞共轉(zhuǎn)染pcDNA3.0和pGL3-Basic-luc質(zhì)粒為空白組,同時(shí)共轉(zhuǎn)染pCMV-βGal質(zhì)粒作為內(nèi)對(duì)照,每種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量均為0.25μg,培養(yǎng)48小時(shí)后,1 000 r/min離心5分鐘搜集細(xì)胞,PBS洗滌2次后,加入250μl Reporter Lysis Buffer,室溫放置 15分鐘,4℃1 000 r/min離心5分鐘,收取20μl上清細(xì)胞裂解液置于測定管中,加入100μl熒光素酶反應(yīng)底物,在熒光分析儀(20/20 nluminometer)測定發(fā)光強(qiáng)度,檢測時(shí)間為20秒。陽性組及陰性組數(shù)據(jù)與空白組的比值表示熒光素酶相對(duì)活性。同時(shí)將裂解液用酶標(biāo)儀檢測βGal的表達(dá)作為內(nèi)對(duì)照對(duì)熒光素酶數(shù)值進(jìn)行校正。

2 結(jié)果

2.1 pcDNA3.0-HMGB1表達(dá)載體成功構(gòu)建 HindⅢ和EcoRⅠ雙酶切得到一條648 bp條帶,HindⅢ和BamHⅠ雙酶切得到一條271 bp條帶,BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切得到一條377 bp條帶,均與預(yù)期分析的結(jié)果一致(圖 1);測序結(jié)果與NCBI上查詢的HMGB1開放性閱讀框序列100%匹配,提示構(gòu)建正確(圖2)。

表1 PCR引物序列Tab.1 Oligonucleotide primers used in PCR for detection of gene transcripts

2.2 HMGB1促進(jìn)p65基因mRNA的表達(dá) 通過RT-PCR檢測顯示,TaxP細(xì)胞中HMGB1的表達(dá)要強(qiáng)于TaxN細(xì)胞,并且轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-HMGB1的TaxN細(xì)胞和TaxP細(xì)胞中HMGB1mRNA的表達(dá)均增強(qiáng),而Tax的mRNA只在TaxP細(xì)胞中檢測到(圖3),通過半定量 PCR檢測 p65發(fā)現(xiàn),在轉(zhuǎn)染有pcDNA3.0-HMGB1的TaxP細(xì)胞(TPH)中PCR第24個(gè)循環(huán)就可見有條帶,而沒有轉(zhuǎn)HMGB1表達(dá)質(zhì)粒的在第28個(gè)循環(huán)才有條帶,轉(zhuǎn)染有HMGB1表達(dá)質(zhì)粒TaxN細(xì)胞(TNH)雖然條帶和沒有轉(zhuǎn)染HMGB1表達(dá)質(zhì)粒的TaxN細(xì)胞都是在第28個(gè)循環(huán)出現(xiàn)條帶,但TNH的條帶明顯比TaxN的條帶亮(見圖 4),從而說明HMGB1對(duì)p65的表達(dá)有促進(jìn)作用。

圖1 限制性酶切分析pcDNA3.0-hHMGB1Fig.1 Restriction analysis of recombinant plasmid pcDNA3.0-hHMGB1

圖2 陽性克隆插入片段的測序結(jié)果Fig.2 The inserted fragments of positive colonies were analyzed by sequencing

2.3 HMGB1促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)p65蛋白的表達(dá) 通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn),pcDNA3.0-HMGB1轉(zhuǎn)染TaxN細(xì)胞和TaxP細(xì)胞后p65蛋白的表達(dá)高于沒有轉(zhuǎn)染HMGB1對(duì)照組,且TPH組p65蛋白的表達(dá)也高于TNH 組(見圖 5、6)。

2.4 HMGB1能夠活化NF-κB通路 pcDNA3.0-HMGB1和 pNF-κB-luc共轉(zhuǎn)染 48小時(shí)后,TaxP細(xì)胞組熒光素酶相對(duì)活性均值均明顯高于對(duì)應(yīng)的TaxN細(xì)胞組的(P＜0.05,P＜0.05);且TPH組NF-κB活性也明顯高于TNH組(P＜0.05),且對(duì)于TaxN細(xì)胞和TaxP細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-HMGB1后NF-κB活性明顯高于相應(yīng)對(duì)照組(P＜0.05)。見圖7。

圖3 RT-PCR檢測 HMGB1和 Tax的mRNA表達(dá)Fig.3 HMGB1 and Tax mRNA levels detected by RT-PCR

圖4 RT-PCR檢測p65的mRNA表達(dá)Fig.4 p65 mRNA levels detected by RT-PCR

圖5 Western blot檢測 HMGB1和p65蛋白Fig.5 The proteins of HM GB1 and p65 detected by Western blot

圖6 HMGB1蛋白和p65蛋白與GAPDH蛋白的比較Fig.6 Comparison of HMGB1 and p65 protein levels in Gray value with GAPDH

圖7 TaxN細(xì)胞和TaxP細(xì)胞的熒光素酶活性Fig.7 Activity of luciferase in TaxP and TaxN cells

3 討論

HMGBl作為重要的晚期炎癥介質(zhì),目前已經(jīng)進(jìn)行了多方位的研究[5]。然而,HMGB1對(duì)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)影響及機(jī)制,尚待探討。在一些腫瘤,如非小細(xì)胞癌、胰腺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌等發(fā)生時(shí)都有HMGB1過表達(dá)的出現(xiàn),其配體RAGE在腫瘤的發(fā)生中也出現(xiàn)高水平,RAGE進(jìn)一步觸發(fā)信號(hào)機(jī)制,激活細(xì)胞內(nèi)的 p38、MAPK及NF-κB等信號(hào)通路,正如當(dāng)前研究所表明的,HMGB1與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、新生血管的形成和腫瘤細(xì)胞的生長、浸潤、轉(zhuǎn)移、增殖、凋亡及耐藥的形成等密切相關(guān)[6-11]。那HMGB1會(huì)不會(huì)與ATL發(fā)病甚至治療相關(guān)呢?

研究已經(jīng)證明,HTLV-1主要侵犯人CD4+T淋巴細(xì)胞,HTLV-1型病毒的tax基因編碼的Tax蛋白在病毒侵犯T細(xì)胞后可明顯促進(jìn)其活化并最終導(dǎo)致病毒感染細(xì)胞轉(zhuǎn)化為ATL細(xì)胞,所以我們選用本實(shí)驗(yàn)室夏云等構(gòu)建的人CD4+的Tax陰性的TaxN細(xì)胞和CD4+的Tax陽性的TaxP細(xì)胞作為研究對(duì)象,研究Tax、HMGB1、NF-κB 的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)表明TaxP細(xì)胞HMGB1的mRNA和蛋白的表達(dá)明顯高于TaxN細(xì)胞,NF-κB活性也明顯高于 TaxN 細(xì)胞,另外 NF-κB亞基p65的mRNA和蛋白表達(dá)也明顯高于TaxN細(xì)胞,分析也提示NF-κB活性和HMGB1表達(dá)呈正相關(guān),這提示Tax作為HTLV1型病毒編碼的重要蛋白,可以導(dǎo)致CD4+T細(xì)胞活化,這與國外及本實(shí)驗(yàn)室報(bào)道相一致,同時(shí)活化后的T細(xì)胞HMGB1表達(dá)高于Tax陰性的 TaxN細(xì)胞,這提示 Tax可以促進(jìn)HMGB1的表達(dá),但是由于Tax蛋白主要存在于早期病毒感染的細(xì)胞,而60%病人的ATL細(xì)胞并不能檢測到Tax蛋白的存在,所以Tax蛋白促進(jìn)HMGB1的表達(dá)應(yīng)該在病毒感染早期即炎癥階段,表達(dá)的HMGB1一方面被釋放至胞外,可能通過自分泌和(或)旁分泌作用于自身或鄰近的T細(xì)胞,并于T細(xì)胞膜表面的RAGE、TLR4、TLR2結(jié)合進(jìn)而刺激NF-κB的活化,活化的NF-κB可促進(jìn)炎癥介質(zhì)的釋放,而炎癥介質(zhì)的釋放必將正反饋地導(dǎo)致NF-κB的持續(xù)活化[12],另外高表達(dá)的HMGB1作為核內(nèi)的一種非組蛋白,可以通過與雙鏈螺旋狀DNA的小溝結(jié)合穩(wěn)定DNA結(jié)構(gòu),使得病毒感染細(xì)胞存活期延長,最終使得病毒感染細(xì)胞發(fā)展為ATL細(xì)胞[11]。由于HMGB1蛋白和NF-κB的正相關(guān),而從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中也可以看出,轉(zhuǎn)染HMGB1表達(dá)載體后的TaxP細(xì)胞(TPH)中的NF-κB通路的活化要比TaxN細(xì)胞(TNH)的強(qiáng),因此我們認(rèn)為在HTLV-1感染的T細(xì)胞中HMGB1可能協(xié)同Tax蛋白激活NF-kB通路從而參與ATL疾病的發(fā)生。實(shí)際上,Yanai等發(fā)現(xiàn)在Hmgb1-/-和Hmgb2-/-小鼠細(xì)胞中,由定向激活胞漿核苷酸反應(yīng)受體的DNA或RNA誘導(dǎo)產(chǎn)生的Ⅰ型IFNs和炎癥細(xì)胞因子受損,三種HMGB蛋白表達(dá)均受抑制的細(xì)胞受損更嚴(yán)重,同時(shí)伴有轉(zhuǎn)錄因子IRF3,NF-kB的受損激活。HMGBs蛋白的缺失嚴(yán)重影響TLR3、TLR7、TLR9被其同源核苷酸的激活。這些結(jié)果說明,在核苷酸介導(dǎo)激活的免疫應(yīng)答體系中,核苷酸反應(yīng)受體的選擇性激活取決于HMGBs與核苷酸這間的反應(yīng),本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與之相符合[13]。

盡管Tax可以促進(jìn)HMGB1表達(dá),但是HMGB1在ATL發(fā)病中究竟扮演什么角色仍需要進(jìn)一步研究。

1 Yang H,Wang H,Czura CJ et al.The cytokineactivity of HMGB1[J].J Leukoc Biol,2005;78(1):1-8.

2 Scaffidi P,Misteli T,Bianchi M E.Release of chromat protein HMGB1 by necrotic cells triggers inflammation[J].Nature,2002;418(6894):191-195.

3 Peloponese JM Jr,Yasunaga J,Kinjo T et al.Peptidylproline cis-trans-isomerase Pin1 interactswith human T-cell leukemia virus type 1 tax and modulates its activation of NF-kappaB[J].J Virol,2009;83(7):3238-3248.

4 夏 云,石 瑛,高 琰 et al.Tax基因表達(dá)細(xì)胞系的建立及其生物學(xué)活性的初步研究[J].中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志,2008;16(6):1425-1429.

5 Reinhard,E.Voll,Vilma Urbonaviciute et al.Highmobility groupbox 1 in the pathogenes is of inflammatory and auto immune diseases[J].IMAJ,2008;10(25):26-28.

6 Volp K,Brezniceanu M L,Bosser S et al.Increased expression of High mobility group box 1(HMGBl)is associated with an elevated level of the anfiapoptotic c-IAP2 protein in human colon carcinomas[J].Gut,2006;55(2):234-242.

7 Ellerman JE,Brown CK,deVera Michael et al.Masquerader:high mobility group Box-1 and cancer[J].Clin Cancer Res,2007;13(10):2836-2848.

8 Kang R,Tang D,Schapiro N E et al.The receptor for advanced glycation end products(RAGE)sustains autophagy and limits apoptosis,promoting pancreatic tumor cell survival[J].Cell Death Differ,2010;17(4):666-676.

9 Lotfi R,Herzog G I,DeMarco RA et al.Eosinophilsoxidize damage-associated molecular pattern molecules derived from stressed cells[J].J Immunol,2009;183(8):5023-5031.

10 Taguchi A,Blood DC,Toro G et al.Blockade of RAGE-amphoter in signaling suppresses tumour growth and metastases[J].Nature,2000,405(6784):354-360.

11 Lotze M T,Tracey K J.High-mobility group box l protein(HMGBI):nuclear weapon in the immune arsenal[J].Nat Rev Immunol,2005;5(4):331-342.

12 DeMareo RA,Fink M P,Lotze M T.Monocytes promote natural killer cell interferon gamma production in response to the endogenous danger signal HMGBl[J].Mol lmmunol,2005;42:433-444.

13 Yanai H,Ban T,Wang Z et al HMGB proteins function as universal sentinels for nucleic-acid-mediated innate immune responses[J].Nature,2009;462(7269):99-103.