新型免疫介導(dǎo)骨髓造血功能衰竭小鼠模型的建立及特性分析

孫 諭 顧 軍 張 宏 張曉慧 張學(xué)光 傅晉翔 (蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院血液科,蘇州215004)

再生障礙性貧血(AA)主要表現(xiàn)為骨髓造血功能低下、全血細(xì)胞減少,其發(fā)病機(jī)制尚未闡明,眾多研究表明免疫異常在AA發(fā)生、發(fā)展中起主要作用[1]。已往的再障的動(dòng)物模型,通過應(yīng)用環(huán)磷酰胺等細(xì)胞毒藥物及放射致骨髓造血損傷是主要手段?，F(xiàn)有研究表明[2],體內(nèi)存在一組具有調(diào)節(jié)作用的T細(xì)胞(T-regs),在體內(nèi)和體外抑制T細(xì)胞反應(yīng)。在一些自身免疫性疾病及相關(guān)的動(dòng)物模型中,人們在CD4+和CD8+T細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)該亞群的存在,CD4+Treg細(xì)胞誘導(dǎo)免疫抑制作用的發(fā)生,而CD8+T-regs不僅是細(xì)胞毒性效應(yīng)T細(xì)胞,且具有免疫抑制作用,從而預(yù)防自身免疫應(yīng)答的發(fā)生[2]。目前認(rèn)為T-regs介導(dǎo)的免疫抑制作用是一種重要的主動(dòng)機(jī)制,通過與其它免疫細(xì)胞直接接觸或分泌抑制性的細(xì)胞因子如IL-10及TGF-β發(fā)揮作用,維持自身免疫耐受。去除T-regs或T-regs細(xì)胞功能異常,均可導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生[3]。近年來越來越多的學(xué)者認(rèn)識到免疫機(jī)制紊亂尤其是細(xì)胞免疫功能紊亂在再障發(fā)病中的作用,本文旨在通過體外誘導(dǎo)建立再生障礙性貧血?jiǎng)游锬Ｐ?了解調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的變化,從而探討T-regs在再障免疫發(fā)病機(jī)制中可能發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型的制備 參照Bloom的實(shí)驗(yàn)方法[4],B6(C57BL/6)和BALB/cBy小鼠均購自中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,將6～16周齡B6(C57BL/6)雄性鼠和BALB/cBy雌性鼠按雌雄配對分籠飼養(yǎng),培育產(chǎn)生cBy/B6F1。取6～12周cBy/B6F1做受體,將雄性B6作為供體,取雄性B6的腹股溝、腋下、側(cè)腋下淋巴結(jié),用PBS打勻并碾壓制成淋巴細(xì)胞勻漿,用100μm的鉬網(wǎng)過濾后,1 000 r/min離心5～10分鐘,然后棄上清,用PBS重懸,制成淋巴細(xì)胞懸液,用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞數(shù)在10×106～40×106L-1。將制成的細(xì)胞懸液從cBy/B6F1的尾靜脈中注入,將cBy/B6F1按注入的淋巴細(xì)胞數(shù)量分成四組,每組小鼠為5～7只(見表1)。注射淋巴細(xì)胞懸液后的cBy/B6F1被特殊照顧,食物和水經(jīng)過輻照。

1.2 外周血的采集、骨髓涂片、骨髓病理活檢 在注射B6淋巴細(xì)胞懸液的cBy/B6F1后,分別在第3、5、9、14天從尾靜脈采集外周血,用SYSMEX-2100血細(xì)胞分類儀進(jìn)行外周血細(xì)胞計(jì)數(shù),并分別于回輸父系淋巴細(xì)胞懸液后第 5、9、14天,各取 cBy/B6F1一只進(jìn)行斷頸處死,取一側(cè)股骨,然后用少量生理鹽水沖洗,制成骨髓涂片,經(jīng)Gimsa染色后,顯微鏡(OLYMPUSBX500)下觀察。當(dāng)出現(xiàn)外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯下降,表現(xiàn)為全血細(xì)胞減少,Hb＜60 g/L,WBC＜2.0×109L-1,Plt＜20×109L-1時(shí),斷頸處死,取一側(cè)股骨,進(jìn)行骨髓涂片,取另一側(cè)股骨,浸泡在10%的福爾馬林溶液中,然后脫鈣,進(jìn)行骨髓病理活檢。

1.3 流式細(xì)胞儀分析 分別于回輸父系淋巴細(xì)胞懸液后第5、9、14天,外周血象呈進(jìn)行性下降,各取cBy/B6F1一只進(jìn)行摘眼球放血,采血約400μl,用紅細(xì)胞裂解液進(jìn)行溶血后,每管放30～50μl,然后加10μl抗體,進(jìn)行雙標(biāo)檢測。選用鼠單克隆抗體CD3-PE 、CD4-FITC 、CD8-FITC 、CD25-PE 、CD28-PE 、CD103-PE 、CD152-PE、CD62L-PE、GITR-PE 標(biāo)記 ,室溫孵育30分鐘,用PBS洗兩次,FCM測定,陰性對照為同型IgG。采用直接免疫熒光標(biāo)記,流式細(xì)胞術(shù)(FCM,Beckman-Coulter產(chǎn)品)分析法。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SAS8.0統(tǒng)計(jì)軟件。數(shù)據(jù)經(jīng)檢驗(yàn)為偏態(tài)分布資料,所有測定值均以M+QR表示。兩變量間比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn),以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)意義。

2 結(jié)果

2.1 輸注淋巴細(xì)胞數(shù)決定受體小鼠骨髓造血功能衰竭的程度 實(shí)驗(yàn)證實(shí),受體鼠血細(xì)胞下降的程度與注入的淋巴細(xì)胞數(shù)量成正相關(guān);血細(xì)胞下降與注入時(shí)間相關(guān)。當(dāng)注入細(xì)胞數(shù)為 10×106/只時(shí),約20%的F1小鼠出現(xiàn)了全血細(xì)胞減少,但無死亡;細(xì)胞數(shù)在11×106～21×106/只時(shí),約40%的小鼠出現(xiàn)全血細(xì)胞減少,其中一只在第21天出現(xiàn)死亡;細(xì)胞數(shù)達(dá)21×106～30×106/只時(shí),受體小鼠均有全血細(xì)胞減少,其中6只在注入后14～21天死亡;細(xì)胞數(shù)為31×106～40×106/只時(shí),所有受體小鼠在輸注后2周時(shí)死亡,(詳見表1)。在注射B6淋巴細(xì)胞懸液的 cBy/B6F1 后,分別在第 3、5、9、14 天從尾靜脈采集外周血,第3天外周血象無明顯變化,可出現(xiàn)淋巴細(xì)胞比例的升高;第5天血象有所下降,Hb在80 g/L左右,WBC＜3.5×109/L,淋巴細(xì)胞比例升高,Plt＜80×109L-1;第9天,血象明顯下降,Hb在60～70g/L,WBC＜2.0×109L-1,淋巴細(xì)胞比例達(dá)70%以上;Plt＜30×109L-1;至第14天,表現(xiàn)為全血細(xì)胞減少,Hb＜60 g/L,WBC＜2.0×109L-1,Plt＜20×109L-1,淋巴細(xì)胞比例占90%以上,出現(xiàn)粒細(xì)胞的缺少;詳見表2。

2.2 輸入淋巴細(xì)胞觸 發(fā)受體鼠產(chǎn)生免疫介導(dǎo)的骨髓造血功能抑制:取下死亡小鼠的一側(cè)股骨,用生理鹽水,5號針尖將骨髓沖出,制成骨髓細(xì)胞涂片,經(jīng)Gimsa染色顯微鏡下觀察,骨髓象呈現(xiàn)骨髓有核細(xì)胞增生低下,粒細(xì)胞比例明顯下降,淋巴細(xì)胞比例上升,巨核細(xì)胞減少或缺如(圖1、2),取另一側(cè)股骨,浸泡在10%的福爾馬林溶液中,然后脫鈣,進(jìn)行骨髓病理活檢。發(fā)現(xiàn)骨髓病理活檢片中骨髓增生減低,主要為脂肪細(xì)胞、淋巴細(xì)胞,并可見巨核細(xì)胞顯著減少,見圖 3、4。

2.3 通過外周血象、骨髓涂片、骨髓活檢證實(shí)為再生障礙性貧血,進(jìn)行流式細(xì)胞儀測調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達(dá),發(fā)現(xiàn)與正常cBy/B6F1存在明顯差異(表2)。并且在我們的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),隨著注入父系淋巴細(xì)胞時(shí)間的增加,血象進(jìn)行性下降,CD4+CD25+、CD8+CD25+、CD8+CD28-較正常cBy/B6F1相比呈下降趨勢,見表3。

表1 輸入淋巴細(xì)胞數(shù)與受體小鼠外周血象變化的關(guān)系Tab.1 The relationship between the infusion of the number of lymphocytes and thechanges in peripheral blood of receptor mice

表2 不同的時(shí)間的血象變化Tab.2 Changes in blood of different times

表3 CD4+、CD8+調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞的比較Tab.3 Comparison of the CD4+,CD8+regulatory T cells

圖1 正常小鼠骨髓象(100×10)Fig.1 Normal micebone marrow(100×10)

圖2 再障小鼠骨髓象(100×10)Fig.2 AA micebonemarrow(100×10)

圖3 正常小鼠骨髓病理活檢圖(20×10)Fig.3 Normal mice bone marrow biopsy(20×10)

圖4 再障小鼠骨髓病理活檢圖(20×10)Fig.4 AA mice bone marrow biopsy(20×10)

3 討論

近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)免疫功能異常在AA的發(fā)生發(fā)展中起主導(dǎo)作用,再生障礙性貧血是一種以造血細(xì)胞為靶細(xì)胞的自身免疫性疾病[5]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)是1999年發(fā)現(xiàn)的一群具有免疫抑制功能的T細(xì)胞亞群,Treg細(xì)胞不同于Th1和Th2細(xì)胞,是具有免疫抑制作用的T細(xì)胞群體,通過與T細(xì)胞直接接觸或分泌抑制性的細(xì)胞因子如IL-10、TNF-β發(fā)揮免疫抑制作用,在維持機(jī)體自身免疫耐受中發(fā)揮重要作用。Treg細(xì)胞可分為 CD4+-Treg和CD8+-Treg細(xì)胞。CD4+Treg細(xì)胞是體內(nèi)自然存在的,能夠分泌 IL-10、IL-4、TGF-β,表達(dá) IL-2Rα,細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原(CTLA-1),對效應(yīng)性T細(xì)胞具有抑制作用,是Treg細(xì)胞的重要亞群,參與腫瘤的生長、自身免疫性疾病的發(fā)生及耐受移植排斥[6]。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞作為獲得性免疫應(yīng)答的有機(jī)組成部分,通過細(xì)胞與細(xì)胞間的直接接觸及分泌抑制性的細(xì)胞因子發(fā)揮免疫抑制作用。CD8+CD28-則是具有免疫抑制作用的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。CD8+CD25+T 細(xì)胞高表達(dá) FOXp3、CCR8、CTLA-4 以及GITR,和腫瘤壞死因子受體-2(TNFR2),這些細(xì)胞經(jīng)活化后表達(dá)CTLA-4和TGF-β。CD8+CD25+的胸腺細(xì)胞通過細(xì)胞間的直接接觸,抑制靶細(xì)胞上IL-2受體α鏈的表達(dá),從而抑制CD25-T細(xì)胞的增殖,它們的這種抑制作用可用抗CTLA-4抗體和抗TGF-β抗體去除。CD8+CD28-細(xì)胞將顯著地抑制自身免疫性腦脊髓炎的發(fā)生和發(fā)展(EAE)[7]。CD8+CD28-亞型表達(dá)CD101、CD103。CD62L是介導(dǎo)自然生成的外周T淋巴細(xì)胞歸巢的表面受體,有可能的機(jī)制是阻止T淋巴細(xì)胞的歸巢可以改變針對移植物的免疫反應(yīng)和免疫排斥[8]。大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明,調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量缺乏和功能紊亂將導(dǎo)致嚴(yán)重或致命的自身免疫性疾病。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞組成性表達(dá)多種與活化/記憶性T細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞表面分子,其中主要是CD25、CD103、CD62L、CD152、GITR。這些標(biāo)記的表達(dá)使得它們能夠用于分離和研究調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。

本實(shí)驗(yàn)選用雄性B6和雌性BABL/cBy培育生成cByB6F1,利用父本的淋巴細(xì)胞,經(jīng)過靜脈注射給子代,誘導(dǎo)產(chǎn)生了骨髓造血功能的衰竭,表現(xiàn)為在2～3周時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)RBC、WBC、Plt的逐漸下降,最后出現(xiàn)全血細(xì)胞的減少,骨髓象表現(xiàn)為有核細(xì)胞增生低下,淋巴細(xì)胞比例相對增高,非造血細(xì)胞易見,接近于人類的再生障礙性貧血標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,受體小鼠沒有出現(xiàn)脫發(fā)、腸道炎癥、腹瀉,或其他GVHD的表現(xiàn)[4]。在我們的實(shí)驗(yàn)中,可見脾臟和肝臟的點(diǎn)狀壞死,但沒有出現(xiàn)皮膚、腸道病變,受體小鼠因造血衰竭死亡,與文獻(xiàn)報(bào)道相似。我們的實(shí)驗(yàn)中 ,發(fā)現(xiàn)了CD4+CD25+和CD8+CD25+、CD8+CD28-調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)的顯著性降低(P＜0.05)。這可能與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的減低,對自身免疫反應(yīng)的抑制作用削弱有關(guān)。在再障模型中,T-regs的顯著降低,使得活化的T細(xì)胞對自身造血組織產(chǎn)生了強(qiáng)烈的免疫反應(yīng),而缺乏了T-regs對針對自身抗原的免疫抑制作用。已有的研究說明CD4+CD25+T-regs具有免疫抑制功能,將去除CD25+細(xì)胞的CD4單陽性T細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移給T細(xì)胞缺陷小鼠,能導(dǎo)致各種器官特異性的自身免疫病,而將CD4+CD25+T-regs和CD4單陽性T細(xì)胞共同過繼轉(zhuǎn)移則能防止自身免疫性疾病的發(fā)生[9]。再障患者中T淋巴細(xì)胞處于活化狀態(tài),并于發(fā)病前T細(xì)胞向骨髓組織選擇性定向歸巢活化增殖,繼而引發(fā)骨髓干/祖細(xì)胞損傷和造血衰竭。我們的試驗(yàn)也證實(shí)了這一點(diǎn),CD62L表達(dá)的異常升高,介導(dǎo)了活化的T淋巴細(xì)胞向骨髓組織的歸巢,而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例下調(diào),使對于活化的T淋巴細(xì)胞對于自身的免疫應(yīng)答反應(yīng)的抑制作用減弱,從而產(chǎn)生了針對自身骨髓的損傷反應(yīng)。已有研究顯示,在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者,其病變關(guān)節(jié)液中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例明顯下調(diào),關(guān)節(jié)滑液中分離的CD4+CD25+T細(xì)胞高表達(dá)CTLA-4、GITR、CD62、MHCII等細(xì)胞活化分子,體外上述細(xì)胞不能抑制CD4+T細(xì)胞分泌TNF-α及IFN-γ,RA患者關(guān)節(jié)滑液中的CD4+CD25+T細(xì)胞并非調(diào)節(jié)性T細(xì)胞,而是活化的CD4+T細(xì)胞(CD25系IL-2R,T細(xì)胞活化后表達(dá)上調(diào))[10]。

我們的實(shí)驗(yàn)證明了調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在再生障礙性貧血中發(fā)病機(jī)制所起的作用,調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的降低,使它對針對自身抗原的免疫反應(yīng)的抑制作用減弱,出現(xiàn)了針對自身骨髓的免疫反應(yīng),使造血前體細(xì)胞和造血干細(xì)胞受到免疫損傷。通過我們的實(shí)驗(yàn),證實(shí)了調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在再生障礙性貧血發(fā)病機(jī)制中的作用,也為治療再障提供了新的思路。深入研究T-regs的生物學(xué)特征、功能將有助于進(jìn)一步闡明機(jī)體免疫調(diào)節(jié)機(jī)制,認(rèn)識在再障發(fā)病中的病理、生理機(jī)制,有利于人為進(jìn)行有效的免疫調(diào)控,并利用提純、體外擴(kuò)增的T-regs進(jìn)行免疫治療。以調(diào)節(jié)性T細(xì)胞為靶點(diǎn),通過藥物影響這群細(xì)胞的功能,進(jìn)而調(diào)節(jié)免疫,可能為我們治療多種免疫相關(guān)疾病提供新的途徑。進(jìn)行有效的免疫調(diào)控,為自身免疫性疾病的免疫治療提供新途徑。

1 Gluckman E,Rokicka-Milewska R,Gordon-Smith E C et al.For the European Group of Blood and Marrow Transplant Working Party of Aplastic Anemia,France.Results of a randomized study of glycosylated rHuG-CSF lenograstim in severe aplastic anemia[J].Blood,1998;92:376a.

2 Forum in immunology Editorial.Introduction:characterization and functions of human T regulatory cells[J].Microbes and Infection,2005;7:1015-1016.

3 Bach J F.Regulatory T cells under scrutiny[J].Nat Rev Immunol,2003;3(3):189-198.

4 Bloom ML,Wolk A G,Simon-Stoos K L et al.A mousemodel of lymphocyte infusion-induced bone marrow failure[J].Exp Hematol,2004;32(12):1163-1172.

5 Rosenfeld S,Follmann D,Nunez O et al.Antithymocyte Golbulin and Cyclosporinefor Severe aplastic anemia:association between hematologic response and long-term Outcome[J].JAMA,2003;289(9):1130-1135.

6 Arlen P,Tsang K Y,Marshall JL et al.The use of a rapid ELISPOT assay to analyze peptide-specific immune responses Icarcinomapatients to peptidevs recombinant poxvirus vaccines[J].Cancer Immunol Immunother,2000;49(10):517-529.

7 Majumdar MK,Thiede M A,Mosca JD et al.Phenotypic and functionalcomparison of cultures of marrow derived mesenchymal stem cells(MSCs)and stromal cell[J].Cell Physiol,1998;176(1):57-66.

8 Christian Stremmel,Wulf Sienel,Stephan Eggeling et al.Inhibition of T cell homing by down-regulation of CD62L and the induction of a Th-2 response as amethod to prevent acute allograft rejection in mice[J].European Journal of Cardio-thoracic Surgery,2006;30:362-369.

9 Mottet C,Uhlig H H,Powrie F.Cutting edge:cure of colitis by CD4+CD25+regulatory T cells[J].Immunol,2003;170(8):3939-3943.

10 Van Amelsfort JM,Jacobs K M,Bijlsma JW et al.CD4+CD25+regulatory T cells in rheumatoid arthritis:differences in the presence,phenotype,and function between peripheral blood and synovial fluid[J].Arthritis Rheum,2004;50:2775-2785.