C4ST-1 在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)

李 青， 周正雄， 堵國(guó)成，2， 李江華*，2， 康 振，2

（1. 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214122；2. 江南大學(xué) 糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫214122）

硫酸軟骨素（chondroitin sulfate，CS）是一類由葡萄糖醛酸和GalNAc 交替組成，并在GalNAc 不同位點(diǎn)硫酸化的線性陰離子多糖[1]。 CS 為防治關(guān)節(jié)病[2-3]和修復(fù)受損的中樞神經(jīng)系統(tǒng)[4-5]的最佳藥物，同時(shí)廣泛地應(yīng)用于食品領(lǐng)域[6]。 CS 根據(jù)其硫酸化位點(diǎn)不同可分為CSA、硫酸軟骨素C（chondroitin sulfate C，CSC）等[7-8]。 目前，CSA 主要從氣管、鯊魚(yú)軟骨[9]等動(dòng)物軟骨組織中提取得到。 但由于動(dòng)物組織中提取的硫酸軟骨素存在過(guò)硫酸化、 產(chǎn)品難以保證一致性、可能攜帶潛在致病因子等因素[10]限制了CSA 的進(jìn)一步應(yīng)用。 作者在前期研究中提出兩步法得到CSA。首先，以Bacillus subtilis 為宿主發(fā)酵生產(chǎn)軟骨素[11]；然后以Pichia pastoris 發(fā)酵生產(chǎn)的C4ST-1 催化軟骨素形成結(jié)構(gòu)單一的CSA[12]。

但相比于Pichia pastoris，E. coli 具有生長(zhǎng)速度快，培養(yǎng)簡(jiǎn)單，遺傳背景清楚等優(yōu)點(diǎn)，其成為重組蛋白表達(dá)的首選。 但該系統(tǒng)缺乏蛋白質(zhì)翻譯后修飾系統(tǒng)，表達(dá)的C4ST-1 經(jīng)常錯(cuò)誤折疊成形成包涵體[12-13]。在本課題組前期工作中， 將來(lái)源于小鼠的C4ST-1在E. coli 中成功地進(jìn)行了表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物基本上都以包涵體形式存在。 C4ST-1 含3 對(duì)二硫鍵， 在E.coli 胞質(zhì)還原性環(huán)境中可能會(huì)使C4ST-1 的二硫鍵無(wú)法折疊或不正確折疊。 近年來(lái)，人們利用硫氧還蛋白還原酶（TrxB）和谷胱甘肽還原酶（Gor）雙突變工程菌株[14-17]，融合氧化性硫氧還蛋白A（TrxA）[18]，或者引進(jìn)二硫鍵從頭形成體系[19]等策略，在E. coli胞質(zhì)中成功實(shí)現(xiàn)了多種二硫鍵蛋白的表達(dá)。 有文獻(xiàn)報(bào)道表明Orgami（DE3）等工程菌株不能催化二硫鍵的從頭合成，蛋白質(zhì)產(chǎn)率可能較低[20]。 Erv1p（EC 1.8.3.2）可以催化二硫鍵從頭形成，向E. coli 細(xì)胞質(zhì)引入二硫鍵從頭形成體系，可能會(huì)大幅提高活性蛋白質(zhì)的產(chǎn)率[20-24]。 DsbC（EC 5.3.4.1）在細(xì)胞質(zhì)過(guò)量表達(dá)能夠促進(jìn)外源蛋白質(zhì)的二硫鍵正確配對(duì)和異構(gòu)化，進(jìn)而提高胞質(zhì)可溶性蛋白質(zhì)表達(dá)水平[25-26]。 本研究通過(guò)在E. coli 中共表達(dá)Erv1p、 DsbC 及C4ST-1，以期實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)產(chǎn)量和酶活的提高。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 宿主和質(zhì)粒菌株E. coli JM109，E. coli BL21（DE3），Saccharomyces cerevisiae S288C 及質(zhì)粒pET-32a（+），pRSFDuet1 均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑和儀器質(zhì)粒DNA 小量制備試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒、酵母基因組提取試劑盒和細(xì)菌基因組提取試劑盒，均購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司；DNA 標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)分子質(zhì)量片段、各種限制性內(nèi)切酶、DNA 連接酶，均購(gòu)于大連寶生物工程有限公司；一步法克隆試劑盒，購(gòu)自NEB公司；SDS-PAGE 預(yù)制膠， 標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)分子質(zhì)量蛋白質(zhì)，購(gòu)自Thermo 公司；胰蛋白胨、酵母提取物，購(gòu)自英國(guó)OXOID 公司；對(duì)硝基硫酸苯酯（PNPS）、3′-磷酸腺苷-5′-磷酸（PAP），均購(gòu)自Sigma-Aldrich 公司；軟骨素制備參照文獻(xiàn)[11]，芳基硫磺基轉(zhuǎn)移酶（ASTIV，EC 2.8.2.1）制備參照文獻(xiàn)[12]，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

DYY-6D 型瓊脂糖水平電泳槽，購(gòu)自北京六一生物科技有限公司；蛋白膠電泳槽，購(gòu)自Thermo 公司；VCX750 型超聲破碎儀， 購(gòu)自美國(guó)SONICS 公司；UV2450 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，購(gòu)自日本島津公司；Avanti J-26XP 低溫高速冷凍離心機(jī)， 購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter 公司。

1.1.3 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件LB 液體培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨10， 酵母提取物5，NaCl 10；pH 調(diào)為7.2（固體培養(yǎng)基添加2 g/dL 瓊脂粉）。

TB 培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨12，酵母提取物24，甘油6，KH2PO4，2.31，K2HPO412.54。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的獲得

1）C4ST-1 的獲得 在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索來(lái)源于小鼠的C4ST-1 （NP_067414） 氨基酸序列，經(jīng)TMHMM 軟件預(yù)測(cè)分析C4ST-1 的第17-37 位氨基酸區(qū)域?yàn)榭缒^(qū)， 因此第38-352 位氨基酸所對(duì)應(yīng)的基因序列（GenBank：AAI37630.1）按照E. coli密碼子偏好性由南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行全基因合成。

2）Erv1p的獲得 采用酵母基因組提取試劑盒提取S. cerevisiaeS288C 基因組。 以S. cerevisiaeS288C 基因組為模板，設(shè)計(jì)引物F1 和R1，PCR 擴(kuò)增獲得Erv1p（GenBank：DAA08125.1）。

3）DsbC的獲得 采用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取E. coliBL21 （DE3） 基因組。 以E. coliBL21（DE3）基因組為模版，設(shè)計(jì)引物F2 和R2，PCR 擴(kuò)增獲得去除信號(hào)肽編碼序列的DsbC（GenBank：CAQ33205.1）。

1.2.2 重組載體的構(gòu)建

1）pET-32a（+）-C4ST-1 的構(gòu)建 設(shè)計(jì)引物F3和R3 將質(zhì)粒pET-32a（+）線性化。 設(shè)計(jì)與線性化質(zhì)粒pET-32a（+）含有同源臂的引物F4 和R4，以合成的C4ST-1 為模板，PCR 擴(kuò)增得到C4ST-1 產(chǎn)物。 將兩步所得產(chǎn)物進(jìn)行同源重組，轉(zhuǎn)化E. coliJM109 感受態(tài)，挑取轉(zhuǎn)化子測(cè)序，測(cè)序正確即獲得重組質(zhì)粒pET-32a（+）-C4ST-1，見(jiàn)圖1。

圖1 質(zhì)粒pET32a（+）-C4ST-1 構(gòu)建過(guò)程Fig. 1 Schematic of the construction of plasid pET32a（+）-C4ST-1

2）pRSFDuet1-Erv1p的構(gòu)建 設(shè)計(jì)引物F5 和R5 將質(zhì)粒pRSFDuet1 線性化。 將PCR 擴(kuò)增獲得的Erv1p片段與線性化質(zhì)粒pRSFDuet1 進(jìn)行同源重組，轉(zhuǎn)化E. coliJM109 感受態(tài)，挑取轉(zhuǎn)化子，測(cè)序正確則重組質(zhì)粒pRSFDuet1-Erv1p構(gòu)建成功，構(gòu)建過(guò)程見(jiàn)圖2（a）。

3）pRSFDuet1-DsbC的構(gòu)建 設(shè)計(jì)引物F6 和R6 將質(zhì)粒pRSFDuet1 線性化。 將PCR 擴(kuò)增獲得的DsbC與線性化質(zhì)粒pRSFDuet1 進(jìn)行同源重組，轉(zhuǎn)化E. coliJM109 感受態(tài)，挑取轉(zhuǎn)化子，測(cè)序正確則重組質(zhì)粒pRSFDuet1-DsbC構(gòu)建成功， 構(gòu)建過(guò)程見(jiàn)圖2（b）。

4）pRSFDuet1-Erv1p-DsbC的構(gòu)建 利用引物F7 和R5 將質(zhì)粒pRSFDuet1-DsbC線性化。 用引物F1 和R7 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增得到Erv1p與線性化載體pRSFDuet1-DsbC進(jìn)行同源重組。 轉(zhuǎn)化E. coliJM109 感受態(tài)，挑取轉(zhuǎn)化子測(cè)序，測(cè)序正確獲得重組質(zhì)粒pRSFDuet1-Erv1p-DsbC，構(gòu)建過(guò)程見(jiàn)圖2（c）。本文中所用引物均列于表1 中。

圖2 表達(dá)載體pRSFDuet1-Erv1p、pRSFDuet1-DsbC、pRSFDuet1-Erv1p-DsbC 的構(gòu)建Fig. 2 Construction of pRSFDuet1-Erv1p，pRSFDuet1-DsbC and pRSFDuet1-Erv1p-DsbC

1.2.3 重組載體的轉(zhuǎn)化與誘導(dǎo)表達(dá)挑取測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E. coliBL21（DE3），挑取單菌落接種于裝有3 mL LB 液體培養(yǎng)基 （含有50 μg/mL氨芐青霉素或卡那霉素）的12 mL 搖菌管中，37 ℃、220 r/min 過(guò)夜培養(yǎng)。 種子液按體積分?jǐn)?shù)2%接種量轉(zhuǎn)接至含50 mL TB （含有50 μg/mL 氨芐青霉素或卡那霉素）的250 mL 三角瓶中，37 ℃、220 r/min 培養(yǎng)至OD6000.6～0.8 左右， 添加終濃度為0.5 mmol/L的IPTG 誘導(dǎo)，25 ℃誘導(dǎo)表達(dá)16 h，收集菌體。

表1 PCR 擴(kuò)增引物Table 1 Primers for PCR amplification

1.2.4 重組載體胞內(nèi)粗酶液制備及其SDS-PAGE檢測(cè)

1） 粗酶液制備 發(fā)酵結(jié)束后，將誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物于4 ℃、7000 r/min 離心10 min，棄上清液。 用pH 7.0的20 mmol/L Tris-HCl 將菌體洗滌2次， 稀釋至OD6002.0～3.0，在冰上超聲破碎（功率300 W，工作4 s，間歇6 s，10 min）。 4 ℃、12000 r/min 離心30 min，分別收集上清液與沉淀。所得上清液即為粗酶液，沉淀用與上清液同體積的pH 7.0 的20 mmol/L Tris-HCl 重懸，備用。

2） SDS-PAGE 檢測(cè) 取30 μL 待檢測(cè)樣品，加入10 μL 的4×上樣緩沖液混勻，于72 ℃變性10 min。取20 μL 變性樣上樣，120 V 開(kāi)始電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑遷移到距底部1～2 cm 處停止電泳。 電泳結(jié)束后， 取出膠塊， 使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的考馬斯亮藍(lán)R250 染色液染色30 min 后純水脫色， 至背景顏色較淺，凝膠成像分析儀拍照備用。

1.2.5 C4ST-1 的酶活性測(cè)定參照本課題組前期工作[12]，向1 mL 20 mmol/L 的Tris-HCl（pH 7.0）反應(yīng)緩沖體系中添加50 mmol/L PNPS，0.5 mmol/L PAP，2 mg ASST IV ，100 mg 軟骨素，粗酶液2 mg，于37 ℃反應(yīng)2 h。 以不加底物或?qū)⒋置敢杭訜崾Щ钭鳛殛幮詫?duì)照，沸水浴100 ℃、5 min 終止反應(yīng)。 酶活力單位的定義為： 在最適反應(yīng)條件 （37 ℃，pH 7.0）下，1 h 內(nèi)催化生成1 μmol/L PNP 所需的酶量。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的擴(kuò)增和重組載體的構(gòu)建

2.1.1 pET-32a （+）-C4ST-1 的構(gòu)建以合成的C4ST-1 為模板， 引物F3 和R3 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增得到大約900 bp 的片段，見(jiàn)圖3（a）。 采用DNA純化回收試劑盒對(duì)單一凝膠片段進(jìn)行回收，回收后的C4ST-1 片段與用引物F4 和R4 擴(kuò)增得到的線性質(zhì)粒pET-32a （+）（圖略） 同源重組， 轉(zhuǎn)化E. coli JM109， 挑取轉(zhuǎn)化子交由上海生工生物工程有限公司測(cè)序， 測(cè)序結(jié)果正確， 重組載體pET-32a （+）-C4ST-1 構(gòu)建成功。

2.1.2 pRSFDuet1-Erv1p 的構(gòu)建以S. cerevisiae S288C 基因組為模板，引物F1 和R1 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增獲得約570 bp 的Erv1p 片段，見(jiàn)圖3（b）。 將回收的Erv1p 片段和用引物F5 和R5 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增得到的線性化載體pRSFDuet1（圖略）進(jìn)行同源重組，轉(zhuǎn)化E. coli JM109，挑取轉(zhuǎn)化子測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示正確，重組載體pRSFDuet1-Erv1p 構(gòu)建成功。

2.1.3 pRSFDuet1-DsbC 的構(gòu)建以E. coli BL21（DE3）基因組為模版，設(shè)計(jì)引物F2 和R2，PCR 擴(kuò)增獲得去除信號(hào)肽的約600 bp 的DsbC 片段，見(jiàn)圖3（c）。 將回收的DsbC 片段與引物F6 和R6 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增得到的線性化載體pRSFDuet1（圖略）進(jìn)行同源重組，轉(zhuǎn)化E. coli JM109 菌株，挑取轉(zhuǎn)化子測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示正確，重組載體pRSFDuet1-DsbC構(gòu)建成功。

圖3 PCR 產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析Fig. 3 Analysis of PCR products by agarose gel electrophoresis

2.1.4 pRSFDuet1-Erv1p-DsbC 的構(gòu)建設(shè)計(jì)引物F7 和R5 PCR 擴(kuò)增得到線性化載體pRSFDuet1-DsbC （圖略）。 用引物F1 和R7 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增得到的Erv1p 片段（圖略）與線性化載體pRSFDuet1-DsbC 同源重組，轉(zhuǎn)化E. coli JM109 菌株，挑取轉(zhuǎn)化子測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示正確。

2.2 C4ST-1 在E. coli 胞質(zhì)表達(dá)的SDS-PAGE分析

將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pET-32a （+）-C4ST-1轉(zhuǎn)化E. coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，獲得命名為E.coli BL21（DE3）- pET-32a（+）-C4ST-1 的宿主菌。以轉(zhuǎn)化空質(zhì)粒pET-32a（+）為對(duì)照。 挑取重組菌單菌落進(jìn)行搖瓶水平發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后對(duì)其胞內(nèi)上清液及胞內(nèi)沉淀進(jìn)行SDS-PAGE 檢測(cè)分析。結(jié)果如圖4 所示，與對(duì)照相比，重組菌在沉淀的5.2×104處有一明顯條帶，上清中未觀察到明顯條帶。 即C4ST-1在E. coli 胞質(zhì)中主要以包涵體的形式存在。

2.3 共表達(dá)DsbC 對(duì)C4ST-1 的影響

以重組菌E. coli BL21 （DE3）- pET-32a （+）-C4ST-1 為出發(fā)菌株制備感受態(tài)細(xì)胞。 將重組質(zhì)粒pRSFDuet1-DsbC 通過(guò)熱擊的方法轉(zhuǎn)化至上述感受態(tài)細(xì)胞中，以轉(zhuǎn)化空質(zhì)粒pRSFDuet1 為對(duì)照。 重組菌經(jīng)過(guò)搖瓶發(fā)酵， 超聲破碎后進(jìn)行SDS-PAGE 分析，結(jié)果見(jiàn)圖5。 DsbC 重組蛋白在E. coli 中成功的進(jìn)行了表達(dá)，其中DsbC（Mr＝2.6×104）以胞內(nèi)可溶形式表達(dá)（泳道3 藍(lán)色箭頭所示）。 C4ST-1 重組蛋白單獨(dú)表達(dá)時(shí)主要以包涵體形式存在（泳道2），可溶部分未見(jiàn)明顯條帶 （泳道1）； 共表達(dá)DsbC 導(dǎo)致C4ST-1 重組蛋白大部分以可溶形式存在 （第3 泳道），小部分以包涵體形式存在（第4 泳道）。 將各重組菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，菌體超聲破碎后所得上清液進(jìn)行酶活測(cè)定， 結(jié)果見(jiàn)圖6。 對(duì)照菌株的酶活為（9.42±0.29） U/L，DsbC 和C4ST-1 共表達(dá)菌株的酶活為（21.99±0.42） U/L，是對(duì)照菌株的2.33 倍。

圖4 C4ST-1 表達(dá)的SDS-PAGE 分析Fig.4 SDS-PAGE result of expression product of C4ST-1

2.4 共表達(dá)Erv1p 對(duì)C4ST-1 的影響

C4ST-1 和Erv1p 共表達(dá)菌株的轉(zhuǎn)化過(guò)程同2.3，將此菌株通過(guò)搖瓶發(fā)酵，超聲破碎后進(jìn)行SDSPAGE 分析，結(jié)果見(jiàn)圖5。 Erv1p 在E. coli 中成功地進(jìn)行了表達(dá)，Erv1p（Mr＝2.63×104）以胞內(nèi)可溶（泳道5 紅色箭頭所示）和不溶的2 種形式存在（泳道6 紅色箭頭所示）。共表達(dá)Erv1p 也能導(dǎo)致C4ST-1 融合蛋白部分以可溶形式存在（第5 泳道），但大部分仍以包涵體形式存在（第6 泳道）。即C4ST-1 與Erv1p共表達(dá)可在一定程度上促進(jìn)C4ST-1 的可溶性表達(dá)，但其對(duì)C4ST-1 的可溶性表達(dá)影響相對(duì)較小。這可能因?yàn)镋rv1p 為直接從酵母基因組中擴(kuò)增得到，含有大量E. coli 稀有密碼子， 在E. coli 中可溶性表達(dá)的量較少，故對(duì)C4ST-1 的促進(jìn)作用有限?？筛鶕?jù)E. coli 密碼子偏好性將Erv1p 進(jìn)行全基因合成，或以含有E. coli 稀有密碼子的Rosetta（DE3）為宿主進(jìn)行表達(dá)。 將C4ST-1 和Erv1p 共表達(dá)菌株進(jìn)行酶活測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖6。 Erv1p 和C4ST-1 共表達(dá)菌株的酶活達(dá)到 （12.32±0.76） U/L， 是對(duì)照菌株的1.30 倍。

2.5 共表達(dá)Erv1p 和DsbC 對(duì)C4ST-1 的影響

C4ST-1、Erv1p 和DsbC 共表達(dá)菌株的轉(zhuǎn)化 過(guò)程同2.3，將此菌株通過(guò)搖瓶發(fā)酵，超聲破碎后進(jìn)行SDS-PAGE 分析，結(jié)果見(jiàn)圖5。 Erv1p 和DsbC 重組蛋白均在E. coli 中成功地進(jìn)行了表達(dá)， 其中Erv1p（Mr＝2.63×104）以胞內(nèi)可溶（泳道7 紅色箭頭所示）和不溶 （泳道8 紅色箭頭所示） 的2 種形式存在；DsbC（Mr＝2.6×104）以胞內(nèi)可溶形式表達(dá)（泳道7 藍(lán)色箭頭所示）。 同時(shí)共表達(dá)C4ST-1、Erv1p 和DsbC導(dǎo)致C4ST-1 重組蛋白部分大部分以可溶形式存在（第7 泳道）， 但沉淀仍見(jiàn)部分包涵體蛋白質(zhì)條帶（第8 泳道）。 將此重組菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，菌體超聲破碎后所得上清液進(jìn)行酶活測(cè)定， 結(jié)果見(jiàn)圖6。C4ST-1、Erv1p 和DsbC 共表達(dá)菌株的酶活比對(duì)照菌株增加2.09 倍，酶活最高可達(dá)（29.12±0.66） U/L。

圖5 共表達(dá)Erv1p 和DsbC 對(duì)C4ST-1 表達(dá)的影響Fig. 5 Effect of co-expression of Erv1p and DsbC on C4ST-1

圖6 共表達(dá)Erv1p 和DsbC 對(duì)C4ST-1 酶活的影響Fig. 6 Effect of co-expression of Erv1p and DsbC on C4ST-1 enzyme activity

2.6 C4ST-1、Erv1p 和DsbC 共表達(dá)菌株3 L 罐培養(yǎng)

為考察同時(shí)共表達(dá)C4ST-1、Erv1p 和DsbC 的菌株能否進(jìn)一步工業(yè)化應(yīng)用， 將此菌株進(jìn)行3 L 罐發(fā)酵培養(yǎng)。 發(fā)酵過(guò)程控制轉(zhuǎn)速250 r/min、溶氧水平在體積分?jǐn)?shù)20%～30%、pH 7.0（流加氨水）左右、起始溫度37 ℃，加入IPTG 后溫度降低至25 ℃。 將保藏在甘油管的菌種接于LB 固體斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取斜面菌種接入LB 液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)10 h 左右。 將種子液以體積分?jǐn)?shù)為4%的接種量轉(zhuǎn)接至裝有1 L TB 培養(yǎng)基的3 L 發(fā)酵罐中，定時(shí)取樣測(cè)定OD600和酶活，結(jié)果見(jiàn)圖7。當(dāng)菌體生長(zhǎng)2 h 左右進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期， 加入終濃度為0.5 mmol/L 的IPTG 進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。 當(dāng)IPTG 誘導(dǎo)至10 h 左右菌體生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期， 其酶活達(dá)到49.97 U/L。 繼續(xù)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，菌體生長(zhǎng)不明顯且酶活有所下降， 故10 h 左右為菌體的最佳產(chǎn)酶時(shí)間，為進(jìn)一步的工業(yè)化應(yīng)用提供技術(shù)支持。

圖7 3 L 發(fā)酵罐酶活變化曲線Fig. 7 Variation curve of enzyme activity under the fermentation condition

3 結(jié) 語(yǔ)

本研究中成功在E. coli 中表達(dá)了老鼠來(lái)源的C4ST-1， 但表達(dá)產(chǎn)物基本上以包涵體的形式存在，限制了其大規(guī)模應(yīng)用。 C4ST-1 含7個(gè)不連續(xù)的半胱氨酸殘基，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)含有2個(gè)以上的非連續(xù)二硫鍵時(shí)，其錯(cuò)誤配對(duì)幾率增大，異常的二硫化物需要異構(gòu)化才能使蛋白質(zhì)達(dá)到天然構(gòu)象[27]。 為獲得高可溶性表達(dá)和高活性的C4ST-1 重組蛋白， 本研究中共表達(dá)了參與二硫鍵從頭形成的Erv1p 和促進(jìn)二硫鍵正確配對(duì)和異構(gòu)化的DsbC。 結(jié)果表明DsbC 和Erv1p 對(duì)C4ST-1 的可溶性表達(dá)量和酶活均有一定程度的提高。將C4ST-1、DsbC 和Erv1p 同時(shí)共表達(dá)的菌株進(jìn)行3 L 發(fā)酵罐放大培養(yǎng)，10 h 左右酶活達(dá)到49.97 U/L，是原始菌株搖瓶的5.30 倍，對(duì)C4ST-1 的廣泛應(yīng)用奠定了一定的基礎(chǔ)。 但本研究中對(duì)活性蛋白質(zhì)的產(chǎn)生條件只進(jìn)行了初步探索，重組蛋白仍有一大部分以包涵體的形式存在。 為進(jìn)一步提高其可溶性表達(dá)量和酶活，一方面可以通過(guò)以胞質(zhì)呈現(xiàn)氧化性環(huán)境的Shuffle 菌株[28-30]為宿主進(jìn)行表達(dá)，另一方面可通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、構(gòu)建不同的融合表達(dá)系統(tǒng)等進(jìn)行嘗試表達(dá)。