外源氧載體和前體L-谷氨酸添加策略提高Bacillus subtilis HB-1 發(fā)酵產(chǎn)γ-聚谷氨酸

任東雪， 陳鵬程， 鄭 璞*， 徐志南， 盧 松

（1. 江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫214122；2. 浙江大學 化學工程與生物工程學院，浙江 杭州310027；3. 內(nèi)蒙古阜豐生物科技有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特010030）

γ-聚谷氨酸（γ-PGA）[1]是一種富含游離羧基的天然環(huán)保型生物高分子材料，相對分子質(zhì)量一般在100～1×104左右， 是由多個D 型和L 型谷氨酸通過酰胺鍵連接而成的高分子聚合物。γ-PGA 作為一種親水性和生物相容性良好的天然聚合物， 在食品、醫(yī)藥[2-5]、化妝品、農(nóng)業(yè)和工業(yè)等領(lǐng)域應用廣泛。 目前制備γ-PGA 的方法主要有提取法， 化學合成法和微生物發(fā)酵法等。γ-PGA 最早是從納豆中分離提取出來的，但是納豆中γ-PGA 濃度甚微，因此提取工藝十分復雜，生產(chǎn)成本甚高；化學制備一般是通過二聚體縮聚法將D/L 型的谷氨酸連接制備成多肽的形式，所需化學試劑較多，制備流程復雜，難以工業(yè)化。

微生物發(fā)酵法[6]具有環(huán)境污染小，天然產(chǎn)物純度高和反應條件溫和的優(yōu)勢。 微生物將內(nèi)源的或者外源的L-谷氨酸通過自身谷氨酸異構(gòu)酶的作用合成D-谷氨酸，然后通過γ-PGA 合成酶將D/L 型的谷氨酸連接成多肽，并且不斷延長形成多肽，自發(fā)分泌到胞外。 目前生產(chǎn)γ-PGA 的菌株主要是芽孢桿菌屬[7-9]，包括L-谷氨酸外源依賴型和非L-谷氨酸依賴型菌株，非L-谷氨酸依賴型主要利用自身合成的L-谷氨酸通過γ-PGA 合成酶[10-11]聚合形成γ-PGA，但是因為其內(nèi)源L-谷氨酸水平有限，嚴重限制了γ-PGA 的產(chǎn)量水平。 Nuttawut[12]篩選了一株非外源L-谷氨酸依賴型菌株Bacillus licheniformisTISTR 1010， 在7 L 發(fā)酵罐擴大培養(yǎng)得到27.5 g/L的γ-PGA；徐艷萍等[13]利用亞硝基胍和60CO 誘變地衣芽孢桿菌，產(chǎn)量僅有23 g/L。隨著代謝工程的發(fā)展，很多研究者關(guān)注γ-PGA 合成酶的異源表達，彭英云[14]將來源于Bacillus methylotrophicusSK19.001的γ-PGA 合成酶基因在大腸桿菌中克隆表達，以L-谷氨酸為底物獲得0.65 g/L 產(chǎn)物γ-PGA；Jun[15]在Bacillus amyloliquefaciens中過表達γ-PGA 合成酶基因（PgsBCA），發(fā)現(xiàn)γ-PGA 產(chǎn)量反而下降；Cao[10]在谷氨酸棒桿菌（C. glutamicum）中表達PgsBCA 基因，但是γ-PGA 產(chǎn)量僅有0.69 g/L；Hao 等[16]在大腸桿菌（Escherichia coliBL21）中表達γ-PGA 合成酶基因，在添加了40 g/L （NH4）2SO4的情況下，γ-PGA產(chǎn)量也僅有3.7 g/L。

由于非L-谷氨酸依賴型菌體和γ-PGA 合成酶異源表達所得的目的產(chǎn)物γ-PGA 產(chǎn)量低，Zhu[17]篩選出一株可以利用秸稈水解糖作為碳源的外源L-谷氨酸依賴型菌株Bacillus subtillisHB-1，在3 L發(fā)酵罐上分批發(fā)酵可獲得23.63 g/L 的γ-PGA。 但是由于發(fā)酵液的黏度較大（1900 mPa·s）[18]，極大地限制了發(fā)酵培養(yǎng)基的溶氧水平，阻礙了菌體的生長和產(chǎn)物的進一步生成，造成前體L-谷氨酸的轉(zhuǎn)化率較低，代謝副產(chǎn)物較多。 作者比較了幾種常見的氧載體對Bacillus subtilisHB-1 菌體生長和γ-PGA產(chǎn)量的影響，選用PDMS 明顯提高了菌體生長和γ-PGA 產(chǎn)量， 并通過前體L-谷氨酸添加時間及其添加量的單因素實驗，提高了前體L-谷氨酸的轉(zhuǎn)化效率。 同時發(fā)酵罐上放大培養(yǎng)，獲得了52 g/L 的目的產(chǎn)物γ-PGA，其相對分子質(zhì)量高達1000 萬，為醫(yī)藥材料、工業(yè)農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域提供了高相對分子質(zhì)量的天然原料，具有比較重要的應用價值。

1材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種實驗室保存枯草芽孢桿菌HB-1（BacillussubtilisHB-1）。

1.1.2 培養(yǎng)基LB 液體培養(yǎng)基：酵母提取物5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，氯化鈉10 g/L；pH 7.0。

LB 固體培養(yǎng)基：在LB 液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入質(zhì)量分數(shù)1.6%的瓊脂粉。

發(fā)酵培養(yǎng)基：胰蛋白胨30 g/L，玉米秸稈混合糖水解液[17]60 g/L，氯化鈉10 g/L，L-谷氨酸40 g/L，氯化鈣1 g/L，七水硫酸鎂1 g/L，一水硫酸錳0.34 g/L；pH 7.0。

1.1.3 主要儀器和設(shè)備冷凍干燥機： 購自美國Labconco 公司；SBA-40C 生物傳感分析儀： 購自山東省科學院生物研究所；氨基酸分析儀：購自美國安捷倫公司；凝膠過濾色譜儀：購自美國沃特世公司。

1.1.4 主要試劑聚二甲氧基硅烷（PDMS）、正庚烷，購自麥克林生物科技有限公司；1-氟-2，4-二硝基苯基-5-L-丙氨酸酰胺 （FDAA）， 購自Sigma 公司；醋酸鈉、三乙胺、四氫呋喃、甲醇、乙腈（分析純），購自上海生工生物工程有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 種子培養(yǎng)取10 ～20 μL 甘油管保存的Bacillus subtilis HB-1， 接種30 mL LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、110 r/min 培養(yǎng)12 h， 取菌液稀釋涂布于LB 固體培養(yǎng)基平板，37 ℃培養(yǎng)箱孵育12 h 左右，挑取單菌落，置于LB 液體培養(yǎng)基，用于下一步培養(yǎng)和發(fā)酵實驗。

1.2.2 氧載體添加量的確定按照1.2.1 種子培養(yǎng)的方法培養(yǎng)種子至對數(shù)期，按照10%的接種體積分數(shù)將生長到對數(shù)期的種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，分別添加體積分數(shù)0、0.5%、1%、3%、5%、10%的正庚烷和體積分數(shù)0、1%、5%、10%、15%、20%的聚二甲氧基硅烷（PDMS），37 ℃、110 r/min 培養(yǎng)48 h，收集發(fā)酵液用于測定OD600和γ-PGA 產(chǎn)量。

1.2.3 氧載體添加時間的確定按照1.2.1 種子培養(yǎng)的方法培養(yǎng)種子至對數(shù)期，按照10%的接種體積分數(shù)將生長到對數(shù)期的種子液置于發(fā)酵培養(yǎng)基，設(shè)置不同的時間梯度（0、6、12、18、24、30、36 h）添加體積分數(shù)10%的氧載體 （PDMS），37 ℃，110 r/min 培養(yǎng)48 h， 收集發(fā)酵液用于測定OD600和γ-PGA產(chǎn)量。

1.2.4 前體L-谷氨酸的添加時間的確定按照1.2.1 種子培養(yǎng)的方法培養(yǎng)種子至對數(shù)期，按照10%的接種體積分數(shù)將生長到對數(shù)期的種子液置于發(fā)酵培養(yǎng)基， 設(shè)置不同的時間梯度（0、6、12、18、24、30、36 h） 添加終質(zhì)量濃度為5 g/L 的前體L-谷氨酸，37 ℃、110 r/min 培養(yǎng)48 h， 收集發(fā)酵液用于測定OD600和γ-PGA 產(chǎn)量。

1.2.5 前體L-谷氨酸添加量的確定按照1.2.1 種子培養(yǎng)的方法培養(yǎng)種子至對數(shù)期，按照10%的接種體積分數(shù)將生長到對數(shù)期的種子液置于發(fā)酵培養(yǎng)基， 分別添加終質(zhì)量濃度為0、5、10、15、20、30 g/L的前體L-谷氨酸，37 ℃、110 r/min 培養(yǎng)48 h， 收集發(fā)酵液用于測定OD600和γ-PGA 產(chǎn)量。

1.2.6 發(fā)酵罐培養(yǎng)3 L 發(fā)酵罐， 裝液量1.5 L，氧載體PDMS 添加體積分數(shù)為10%， 種子液OD600為6.0 左右時，按照體積分數(shù)為5%的接種量接入發(fā)酵罐，溫度自控為37 ℃，通氣量1～2 vvm，攪拌轉(zhuǎn)速400～1000 r/min 維持溶氧水平在體積分數(shù)20%以上， 體積分數(shù)10%氨水和2 mol/L 鹽酸控制發(fā)酵過程pH 穩(wěn)定在7.0。 在一次性補料中，在發(fā)酵25 h 一次性向培養(yǎng)基中添加終質(zhì)量濃度為10 g/L 的前體L-谷氨酸；在流加發(fā)酵中，當葡萄糖質(zhì)量濃度低于5 g/L 時， 使用蠕動泵按照15～20 mL/h 的流速將200 g/L 的玉米秸稈混合糖溶液[17]注入發(fā)酵罐，維持罐中質(zhì)量濃度在5～10 g/L 范圍內(nèi)； 當前體L-谷氨酸質(zhì)量濃度低于10 g/L 時， 使用蠕動泵按照20～30 mL/h 的流量添加300 g/L 的前體L-谷氨酸，維持其質(zhì)量濃度在10 g/L。 間隔3～5 h，取10 mL 發(fā)酵液，測定OD600，前體L-谷氨酸、葡萄糖、木糖及其產(chǎn)物γ-PGA 質(zhì)量濃度。

1.3 分析方法

1.3.1 生物量檢測以去離子水為空白對照，利用可見光分光分度計在波長為600 nm 處檢測培養(yǎng)液的吸光值OD600，表示生物量。

1.3.2 葡萄糖以及前體L-谷氨酸的檢測用蒸餾水將離心后的發(fā)酵上清液稀釋100 倍后， 取25 μL稀釋后的樣品液注入SBA-40C 測量剩余葡萄糖和剩余前體L-谷氨酸的量。

1.3.3 γ-PGA 產(chǎn)量測定取5 mL 發(fā)酵液12000 r/min離心30 min 除去菌體， 加入15 mL 乙醇沉淀，4 ℃沉淀12 h 左右，12000 r/min 離心30 min 除去雜質(zhì)，沉淀置于60 ℃真空干燥箱烘干稱質(zhì)量，為粗略計算的γ-PGA 產(chǎn)量。取水解管，稱取100.0 mg 左右固體發(fā)酵產(chǎn)物γ-PGA，加8 mL 6 mol/L 鹽酸，充氮氣3 min，調(diào)流量，使溶液呈微沸狀態(tài)，擰緊水解管蓋。放入已設(shè)定為120 ℃的烘箱中，水解22 h。2 mol/L NaOH 中和后濾紙過濾，15000 r/min 離心30 min，取400 μL 上清液用于D/L 谷氨酸衍生化。

D/L 谷氨酸衍生化方法[19]：取10 μL 上述制備的γ-PGA 酸水解上清液， 加入8 μL 的1 mol/L 的NaHCO3和40 μL 1-氟-2，4-二硝基苯基-5-L-丙氨酸酰胺（FDAA）丙酮溶液（10 mg/mL）于1.5 mL 的離心管中，40 ℃水浴鍋加熱1 h，加熱結(jié)束后冷卻至室溫，加入8 μL 1 mol/L 的鹽酸，最后加入934 μL體積比為40∶60 的乙腈和水混合液， 混勻后過有機濾膜。 色譜柱：Develosil ODS-UG-5 （150 mm×4.6 mm），流動相A：水（含體積分數(shù)為0.05%的三氟乙酸），流動相B：乙腈（含體積分數(shù)為0.05%的三氟乙酸），流速：1.0 mL/min，檢測波長：340 nm，柱溫：40℃，進樣量：20 μL，洗脫程序：0 min：流動相B 的體積分數(shù)為20%，40 min： 流動相B 的體積分數(shù)為40%，45 min：流動相B 的體積分數(shù)為50%。

1.3.4 γ-PGA 提取純化取50 mL 發(fā)酵液12000 r/min 離心30 min 除去菌體，加入150 mL 無水乙醇反復沉淀3～5次，12000 r/min 離心30 min 去除上清液，取沉淀下來的γ-PGA 溶于50 mL 無菌水中，置于透析袋，放入2 L 蒸餾水中透析3～5 d，去除雜質(zhì)和小相對分子質(zhì)量的γ-PGA， 將透析袋內(nèi)的γ-PGA 水溶液冷凍干燥，得到白色γ-PGA 純品。

1.3.5 傅立葉變換紅外光譜 （FTIR）干燥成粉末狀的發(fā)酵產(chǎn)物采用傅立葉變換紅外光譜進行檢測其特定吸收峰，掃描波長為4500～500 cm-1。

1.3.6 氨基酸分析儀測定發(fā)酵產(chǎn)物中氨基酸組分酸水解后的發(fā)酵產(chǎn)物使用氨基酸分析儀檢測單體氨基酸組成。色譜柱：Agilent Hypersil ODS（4.0 mm×250 mm）， 流動相A：27.6 mmol/L 醋酸鈉-三乙胺-四氫呋喃（體積比為500∶0.11∶2.5）， 流動相B：80.9 mmol/L 醋酸鈉-甲醇-乙腈（體積比為1∶2∶2），流速：1.0 mL/min，檢測器波長：338 nm，柱溫：40 ℃，進樣量：20 μL，洗脫程序：0 min：流動相B 的體積分數(shù)為8%；17 min： 流動相B 的體積分數(shù)為50%；20 min：流動相B 的體積分數(shù)為100%；24 min：流動相B 的體積分數(shù)為0%。

1.3.7 γ-PGA 相對分子質(zhì)量測定凝膠過濾色譜法（Gel filtration chromatography，GFC）[20]測 定γ-PGA 相 對 分 子 質(zhì) 量， 色 譜 柱：UltrahydrogelTMLinear（300 mm×7.8 mm），流動相：0.1 mol/L NaNO3，流速：1.0 mL/min，柱溫：45 ℃，進樣量：20 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 氧載體的選擇

氧氣在好氧發(fā)酵中起著重要的作用，特別是對于高黏度的聚合物生產(chǎn)中。 γ-PGA 黏度大，在發(fā)酵過程中嚴重影響了菌體的正常生長和γ-PGA 產(chǎn)量的進一步提高。 一種獲得更好的氧供應的方法是通過添加氧載體來增加氧在培養(yǎng)基中的溶解度。 氧載體一般為疏水性液體， 其中氧的溶解度比水高15～20 倍，可以大幅度提高空氣中的氧氣在液體培養(yǎng)基中的溶解度，供給菌體生長和代謝充足的氧氣。 有報道表明，正十二烷被添加到培養(yǎng)基中，改善了透明質(zhì)酸（HA）、多糖、二十二碳六烯酸、番茄紅素、β-胡蘿卜素等的生產(chǎn)[21]。 因此作者選擇正己烷、正庚烷、正十二烷、正十六烷和PDMS 等5 種氧載體添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)5 種氧載體都明顯提高了菌體的生長（圖1），其中PDMS、正十二烷和正十六烷最為明顯，但后兩者卻降低了γ-PGA 的產(chǎn)量，而正庚烷和PDMS 能夠有效提高γ-PGA 的產(chǎn)量。 因此選用正庚烷和PDMS 作為氧載體，研究其體積分數(shù)對生物量和γ-PGA 產(chǎn)量的影響。

圖1 不同氧載體對菌體生長和γ-PGA 產(chǎn)量的影響Fig. 1 Effect of different oxygen carriers on cell growth and γ-PGA production

2.2 正庚烷和PMDS 添加量對生物量和γ-PGA產(chǎn)量的影響

Zhang 等[22]報道氧載體正庚烷的添加使得細胞的NADH/NAD+比例升高，糖酵解（EMP）和三羧酸循環(huán)（TCA）的碳代謝流量增加，從而提高了γ-PGA的產(chǎn)量。 因此本研究中推測氧載體可以提供EMP、TCA 循環(huán)中需要ATP 的酶和γ-PGA 合成酶足夠的氧氣，促進了菌體生長和γ-PGA 的產(chǎn)生。 本研究在發(fā)酵培養(yǎng)基中初始添加體積分數(shù)為1%的正庚烷，發(fā)現(xiàn)菌體量明顯提高，γ-PGA 產(chǎn)量也由原來的23 g/L 提高到28 g/L（圖2 （a）），但是過量的正庚烷對菌體毒害作用明顯，使得菌體OD600明顯下降，體積分數(shù)為10%的正庚烷使得菌體完全不能生長，因此正庚烷對菌體的毒性限制了其應用。 PDMS 作為一種無毒無害的聚合物， 在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加PDMS，發(fā)現(xiàn)隨著PDMS 添加量的增加，菌體生長速率明顯提高， 產(chǎn)物質(zhì)量濃度隨著菌體的生長而增加。 添加體積分數(shù)10%～20%左右的PDMS 后，菌體生長較原來提高了3～5 倍，γ-PGA 產(chǎn)量能達到32 g/L，較對照組提高了39%（圖2（b））。

圖2 正庚烷和PDMS 添加量對菌體生長和γ-PGA 產(chǎn)量的影響Fig. 2 Effects of the addition of n-heptane and PDMS on cell growth and γ-PGA production

2.3 正庚烷和PDMS 添加時間對生物量和γ-PGA 產(chǎn)量的影響

進一步考察了氧載體在菌株前期、中期和后期添加對菌體生長和產(chǎn)γ-PGA 的影響。 如圖3 所示，無論是正庚烷還是PDMS， 都是在發(fā)酵前期添加利于菌體生長和γ-PGA 的產(chǎn)生， 推測其原因可能在于Bacillus subtilis HB-1 產(chǎn)γ-PGA 屬于生長偶聯(lián)型， 菌體快速生長的同時才能產(chǎn)生更多的目的產(chǎn)物，一旦菌體生長受到限制，就會引起產(chǎn)物γ-PGA合成的相關(guān)酶的酶活降低，進而降低前體L-谷氨酸的轉(zhuǎn)化率，降低了產(chǎn)物γ-PGA 的質(zhì)量濃度。 通過比較γ-PGA 產(chǎn)量， 發(fā)現(xiàn)正庚烷和PDMS 最適添加時間均為0 h，鑒于正庚烷的細胞毒性，最終選擇在初始發(fā)酵培養(yǎng)基中添加體積分數(shù)10% PDMS 來提高γ-PGA 產(chǎn)量。

圖3 正庚烷和PDMS 添加時間對菌體生長和γ-PGA 產(chǎn)量的影響Fig. 3 Effects of the addition time of n-heptane and PDMS on cell growth and γ-PGA production

2.4 前體L-谷氨酸添加時間和添加量的確定

作為L-谷氨酸依賴型的菌株， 前體L-谷氨酸的添加是決定γ-PGA 產(chǎn)量的重要的因素之一，前期實驗發(fā)現(xiàn)原始培養(yǎng)基添加少量的前體L-谷氨酸不能滿足菌體合成大量的γ-PGA，而培養(yǎng)基中直接添加過量的前體L-谷氨酸會使得菌體將其作為碳源利用而造成前體L-谷氨酸的浪費難以高效合成產(chǎn)物γ-PGA。因此選擇在菌體生長對數(shù)期及穩(wěn)定期前后一次性添加一定量前體L-谷氨酸（終質(zhì)量濃度為5 g/L）。 如圖4（a），在發(fā)酵18 h 添加時，γ-PGA產(chǎn)量較高，約為34 g/L，比對照組產(chǎn)量提高了30%，前體L-谷氨酸的轉(zhuǎn)化率為75%，相比對照組提高了15%。推測γ-PGA 合成酶的活性與菌體生長密切相關(guān)，在對數(shù)生長期間菌體γ-PGA 合成酶酶活較高，在此期間加入前體L-谷氨酸，可以促進其高效轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物γ-PGA，待菌體生長到穩(wěn)定期后，γ-PGA 合成酶酶活降低， 導致前體L-谷氨酸利用率降低，產(chǎn)物質(zhì)量濃度降低。 同時，合適的前體L-谷氨酸添加質(zhì)量濃度對產(chǎn)物產(chǎn)量也很重要，圖4（b）顯示，添加終質(zhì)量濃度為10 g/L 的前體L-谷氨酸得到了43 g/L的產(chǎn)物，前體L-谷氨酸轉(zhuǎn)化率提高到86%。

圖4 前體L-谷氨酸添加時間和添加質(zhì)量濃度對菌體生長和γ-PGA 產(chǎn)量的影響Fig. 4 Effects of precursor L-glutamic acid addition time and addition amount on cell growth and γ-PGA production

2.5 3 L 發(fā)酵罐分批發(fā)酵

在添加了體積分數(shù)為10%的氧載體PDMS 的基礎(chǔ)上，進行3 L 發(fā)酵罐發(fā)酵。 從圖5（b）可以看出發(fā)酵初期菌體生長迅速，在20 h 左右OD600達到55以上，生物量比沒有添加氧載體的對照（圖5（a））提高了1.2 倍， 菌體快速生長的同時伴隨葡萄糖、木糖、 前體L-谷氨酸的快速消耗和產(chǎn)物γ-PGA 的同步生成，說明菌體生長和產(chǎn)γ-PGA 是同步進行的。氧載體的添加促進菌體生長的同時也促進了前體L-谷氨酸的轉(zhuǎn)化， 對照組40 g/L 的前體L-谷氨酸最終得到26 g/L 的γ-PGA， 前體L-谷氨酸轉(zhuǎn)化率為65%；而添加了體積分數(shù)10% PDMS 后，得到35 g/L 的γ-PGA，轉(zhuǎn)化率提高到87.5%。說明氧載體的添加有效提高了前體L-谷氨酸的轉(zhuǎn)化率，從而提高了γ-PGA 的產(chǎn)量。

圖5 3 L 發(fā)酵罐批次發(fā)酵曲線對照添加體積分數(shù)10%PDMSFig. 5 Batch fermentation curves of control and 10%PDMS in 3 L fermentation tank

2.6 3 L 發(fā)酵罐一次性補加前體谷氨酸發(fā)酵

前體L-谷氨酸供應不足也可能會造成產(chǎn)物γ-PGA 的產(chǎn)量無法進一步提高， 在發(fā)酵過程中，25 h左右前體L-谷氨酸開始大量消耗，質(zhì)量濃度降低到20 g/L，此時添加終質(zhì)量濃度為10 g/L 的前體L-谷氨酸，菌體開始大量利用其產(chǎn)生γ-PGA，最終獲得了45 g/L 的γ-PGA， 前體L-谷氨酸的轉(zhuǎn)化率進一步提高到90%（圖6）。

2.7 3 L 發(fā)酵罐流加碳源和前體谷氨酸發(fā)酵

在發(fā)酵過程中，碳源是菌體生長的主要因素[23]，枯草芽孢桿菌HB-1 生長和發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA 是同步進行的，因此如果碳源消耗殆盡，菌體不再生長，那么即使有充足的前體L-谷氨酸，γ-PGA 合成酶的合成能力也有限。 故采用流加碳源的方式以滿足菌體的能量供應，同時流加前體L-谷氨酸使得菌體大量合成γ-PGA。 結(jié)果如圖7 所示，維持碳源質(zhì)量濃度在5 g/L 上下， 維持前體L-谷氨酸在10 g/L 左右，在發(fā)酵50 h 后產(chǎn)物γ-PGA 高達52 g/L，較單純補加前體L-谷氨酸提高了15%，比搖瓶發(fā)酵提高了1 倍左右。

圖6 枯草芽孢桿菌HB-1 一次性補加前體L-谷氨酸發(fā)酵曲線（體積分數(shù)10% PDMS）Fig. 6 Fermentation curve of Bacillus subtilis HB-1 with one -time supplement of precursor L -glutamate（10% PDMS）

圖7 枯草芽孢桿菌HB-1 流加碳源和前體L-谷氨酸發(fā)酵曲線（體積分數(shù)10% PDMS）Fig. 7 Fed-batch fermentation curve of Bacillus subtilis HB-1 （10% PDMS）

2.8 發(fā)酵產(chǎn)物的提取與鑒定

2.8.1 發(fā)酵產(chǎn)物的提取發(fā)酵獲得的混合液離心去除菌體，根據(jù)γ-PGA 不溶于乙醇的性質(zhì)，采用3倍體積的乙醇沉淀目的產(chǎn)物， 將其烘干后得到圖8（a）所示的黃色粗品，之后將其重新溶于蒸餾水中，采用透析的方法除去粗品中的小分子雜質(zhì)，將透析得到的產(chǎn)物冷凍干燥得到白色的純品γ-PGA（圖8（b）），采用酸水解的方法測定產(chǎn)物中D/L 谷氨酸的含量，確定γ-PGA 的純度為96%（質(zhì)量分數(shù)）。

圖8 提取的發(fā)酵產(chǎn)物樣品Fig. 8 Extracted crude and pure fermentation products

2.8.2 發(fā)酵產(chǎn)物的紅外圖譜傅立葉紅外光譜可以根據(jù)吸收峰的位置和強度判斷未知化合物的化學基團，從而確定其分子結(jié)構(gòu)。 圖9 為發(fā)酵純化的產(chǎn)物在4000 ～500 cm-1的傅立葉紅外光譜圖，3374.87 cm-1處吸收峰為N－H 對稱伸縮振動帶； 2919.75 cm-1為－CH2的伸縮振動吸收峰；1592.06 cm-1處吸收峰為酰胺中－C＝O 伸縮振動帶（酰胺吸收帶I）；1402.95 cm-1處吸收峰為酰胺中N－H 彎曲振動和C－N 伸縮振動的耦合（酰胺吸收帶II）； 1259.82 cm-1為C－N 伸縮振動（酰胺吸收帶III）， 以上特征峰的存在表明產(chǎn)物為聚酰胺類化合物。

圖9 發(fā)酵產(chǎn)物的紅外光譜圖Fig. 9 Infrared spectrum of the fermentation product

2.8.3 發(fā)酵產(chǎn)物酸水解混合液分析鑒定采用酸水解的方法分解發(fā)酵產(chǎn)物，采用氨基酸分析儀測定目的產(chǎn)物的氨基酸組成，結(jié)構(gòu)如圖10 所示，發(fā)酵產(chǎn)物的單體組成全部是D/L 谷氨酸，無其他氨基酸組分，D/L 谷氨酸衍生化后， 測定D/L 谷氨酸的比例，結(jié)果表明發(fā)酵產(chǎn)物D/L 配比為1∶3（圖11）。 結(jié)合紅外光譜的結(jié)果，證明發(fā)酵產(chǎn)物為D/L 谷氨酸通過酰胺鍵連接而成的多肽類化合物。

圖10 氨基酸分析儀測定發(fā)酵產(chǎn)物的氨基酸組分Fig. 10 Determination of the amino acid composition of the fermentation product by an amino acid analyzer

圖11 谷氨酸衍生化法測定發(fā)酵產(chǎn)物的D/L 谷氨酸比例Fig. 11 Determination of D/L glutamic acid ratio of fermentation products by glutamic acid derivatization

2.8.4 產(chǎn)物相對分子質(zhì)量的測定采用凝膠過濾色譜法測定發(fā)酵產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量，得到不同相對分子質(zhì)量的峰吸收，主要峰為peak Ⅰ，相對分子質(zhì)量為1000 萬左右， 目前沒有報道其他微生物發(fā)酵制備如此高相對分子質(zhì)量的γ-PGA，此外還存在一些小峰，但是含量較低，說明γ-PGA 在前體L-谷氨酸在發(fā)酵過程中逐步合成低相對分子質(zhì)量的短鏈γ-PGA，在發(fā)酵過程中不斷延長，最終得到高達1000 萬的γ-PGA，見圖12。

圖12 γ-PGA 相對分子質(zhì)量的測定Fig. 12 Molecular weight of γ-PGA

3 結(jié) 語

作者采用在發(fā)酵過程中添加氧載體（PDMS）和前體L-谷氨酸來提高Bacillus subtilis HB-1 產(chǎn)γ-PGA 的能力，在搖瓶發(fā)酵實驗中，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加體積分數(shù)10%的PDMS， 使得菌體生物量提高了3～5 倍，γ-PGA 產(chǎn)量提高了39%；在菌體生長對數(shù)期添加終質(zhì)量濃度為10 g/L 的前體L-谷氨酸，γ-PGA 產(chǎn)量達到43 g/L，前體L-谷氨酸轉(zhuǎn)化率達到86%。 在3 L 發(fā)酵罐上控制流加碳源和前體L-谷氨酸的質(zhì)量濃度，γ-PGA 產(chǎn)量最終達到52 g/L，較原始提高了1 倍。 發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)紅外，氨基酸分析儀測定為D/L 谷氨酸經(jīng)過酰胺鍵連接成的多肽類化合物，產(chǎn)物γ-PGA 中D/L 谷氨酸比例為1∶3，相對分子質(zhì)量高達1000 萬。