野生蒙古口蘑多糖通過STAT3 和HIF-1α 通路對(duì)LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞發(fā)揮抗炎調(diào)節(jié)作用

于傳宗， 張鳳蘭， 慕宗杰， 李子欽， 孫峰成， 郝麗珍*

（1 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝與植物保護(hù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特010018；2. 內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特010031）

炎癥是人體為保護(hù)自身免受外來環(huán)境侵害的防御系統(tǒng)[1]。 在炎癥過程中，巨噬細(xì)胞通過釋放前列腺素和促炎性細(xì)胞因子 （TNF-α、IL-6、IL-1α 和IL-1β）等，對(duì)有害物刺激物（如食物、病原體、藥物）的侵?jǐn)_做出反應(yīng)，這一過程稱為吞噬作用[2]。 在這個(gè)過程中，吞噬細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生具有毒性的副產(chǎn)物，包括活性氧如一氧化氮（NO）、過氧化氫（H2O2）、超氧陰離子（O2-），雖然這些炎癥介質(zhì)在機(jī)體防御機(jī)制中是必不可少的，但是過量的活性氧會(huì)對(duì)細(xì)胞的氧化應(yīng)激產(chǎn)生壓力， 引起的慢性炎癥會(huì)持續(xù)地破壞組織。炎癥已經(jīng)被證明與各種疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，如糖尿病[3]、老年癡呆癥[4]、心血管疾病[5]和癌癥[6]。 已經(jīng)有很多抗炎癥的藥物被開發(fā)并在臨床獲得應(yīng)用，控制和回復(fù)異常的炎癥。 目前主要的有2 類抗炎藥，最主要且用量最大的非甾體類抗炎藥， 如阿司匹林、對(duì)乙酰氨基酚、吲哚美辛、萘普生、雙氯芬酸、布洛芬、尼美舒利、羅非昔布、塞來昔布等；甾體類抗炎藥，如潑尼松、地塞米松等。 這些抗炎藥的使用已被證明會(huì)誘發(fā)死亡[7]，也有研究表明非甾體類抗炎藥的使用會(huì)引起肝損傷[8]。 尋找更有效安全的抗炎藥，是研究的一個(gè)熱點(diǎn)。 蒙古口蘑多糖提取物已經(jīng)被證明具有抗炎癥、抗氧化的作用[9]，然而其作用機(jī)制和作用途徑仍然不清楚。 細(xì)菌內(nèi)毒素（LPS）通過Toll樣受體4 （toll-like receptor 4, TLR 4） 激活巨噬細(xì)胞，是慢性炎癥巨噬細(xì)胞（RAW 264.5）的強(qiáng)效刺激物之一[10]，作者通過LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞，選取炎癥與氧化應(yīng)答相關(guān)的基因Hypoxia-induciblefactor1α （HIF-1α）、Nuclear factor-κB（NF-κB）、Signal transducer and activator of transcription3protein（STAT3）、Cyclooxygenase -2 （COX -2） 和Inducible nitric oxide synthase（iNOS）檢測(cè)蒙古口蘑多糖影響細(xì)胞炎癥反應(yīng)，發(fā)揮抗炎作用的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

Cell Counting Kit： 購自日本同仁化學(xué)-東仁化學(xué)科技 （上海） 有限公司；LPS，S-Methylisothiourea Sulfate（SMT）：購自Sigma-aldrich 公司；細(xì)胞RNA提取試劑盒： 購自北京天根生化科技有限公司；Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit，Maxima SYBR Green qPCR Master Mix： 購自Thermo Fisher公司；RPMI 1640 培養(yǎng)基： 購自BI 公司； 胎牛血清FBS：購自北京四季青生物科技有限責(zé)任公司；Anti-COX2 antibody： 購 自Abcam 公 司；HIF1α Rabbit Polyclonal antibody，NF-κB Rabbit Polyclonal antibody，STAT3 Rabbit Polyclonal antibody： 購自Proteintech公 司 ；Anti -GAPDH Monoclonal Antibody，HRP affinipure Goat Anti-Rabbit igG（H+L），HRP affinipure Goat Anti-Mouse igG（H+L）：購自Earthox 公司；超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒：購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Mouse IL-1β ELISA kit （小鼠白細(xì)胞介素-1β），Mouse TNF-α ELISA kit （小鼠腫瘤壞死因子-α）：購自欣博盛生物科技有限公司；引物：由上海生工生物工程股份有限公司合成。

ND-1000 型微量紫外分光光度計(jì)、 凍干機(jī)、普通PCR 儀：購自Thermo Fisher 公司；5430R 低溫臺(tái)式冷凍離心機(jī)：購自Eppendorf 公司；BG-power5000型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀：購自北京百晶生物技術(shù)有限公司；實(shí)時(shí)定量PCR 儀：購自Bio-rad 公司；凝膠成像系統(tǒng)：購自GE Healthcare 公司等。

1.2 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

蒙古口蘑采摘于內(nèi)蒙古錫林郭勒草原， 切片，在（-50±3） ℃，凍干48 h，自動(dòng)勻漿機(jī)勻漿后，取粉末100 g 加入體積分?jǐn)?shù)80% 1 L 的乙醇， 室溫3 d，上清液即為質(zhì)量濃度100 g/L 的多糖提取物（Tricholoma mongolicum polysaccharide extract，TMPE）[11]。 小鼠巨噬細(xì)胞（RAW264.7），培養(yǎng)條件：1640 培養(yǎng)基、10% FBS、37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)期RAW264.7 細(xì)胞懸液接種于96 孔板，接種密度為5×105個(gè)/mL，每孔100 μL，12 h 后加入不同質(zhì)量濃度的TMPE，TMPE的質(zhì)量濃度設(shè)定為0、0.01、0.1、1、10、100 μg/mL，每組6個(gè)復(fù)孔，加入10 μL CCK-8 進(jìn)行細(xì)胞活力測(cè)定。

1.3.2 TMPE 抗炎效果檢測(cè)實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)期RAW264.7 細(xì)胞懸液接種于96 孔板， 接種密度為5×105個(gè)/mL， 每孔100 μL，12 h 后加入LPS 刺激，設(shè)置空白對(duì)照組、LPS（1 μg/mL）組、LPS（1 μg/mL）+SMT（6 μmol/mL）組、LPS（1 μg/mL）+TMPE（0.01 μg/m）組、LPS（1 μg/mL）+TMPE（0.1 μg/mL）組、LPS（1 μg/mL）+TMPE（1 μg/mL）組、LPS（1 μg/mL）+ TMPE（1 μg/mL）組，每組6個(gè)復(fù)孔，作用24 h 后，收集上清液通過Griess 法測(cè)定上清液中的一氧化氮（Nitric oxide，NO）含量[12]，Elisa 測(cè)定TNF-α、IL-1β 的含量。

1.3.3 RNA 的提取、 反轉(zhuǎn)錄及定量取對(duì)數(shù)期RAW264.7 細(xì)胞懸液接種于6 孔板， 接種密度為1×106個(gè)/mL， 每孔2000 μL，12 h 后加入LPS 刺激，設(shè)置空白對(duì)照組，作用12 h 后，收集細(xì)胞并提取RNA 和蛋白質(zhì)，RNA 的提取按照北京天根生化試劑說明書進(jìn)行， 所提RNA 通過微量分光光度計(jì)測(cè)定濃度。并用1.2 g/dL 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 的質(zhì)量， 按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kits 說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。 按照Maxima SYBR Green qPCR Master Mix 說明書進(jìn)行實(shí)時(shí)定量實(shí)驗(yàn)測(cè)定mRNA 表達(dá)量，引物退火溫度均為60 ℃，至少5個(gè)復(fù)孔，其他參照說明書，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)表達(dá)量分析。 以GAPDH 作為管家基因，NCBI 中提供的mRNA成熟序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)定量擴(kuò)增引物。 引物序列如表1。

表1 引物序列Table 1 Sequences of primers

1.3.4 免疫印跡取對(duì)數(shù)期RAW264.7 細(xì)胞懸液接種于6 孔板，接種密度為1×106個(gè)/mL，每孔2000 μL，12 h 后加入LPS 刺激， 設(shè)置空白對(duì)照組，作用12 h 后，提取蛋白質(zhì)，采用BCA 蛋白質(zhì)定量試劑盒檢測(cè)總蛋白質(zhì)的濃度，SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，封閉，抗體孵育，ECL 顯色。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS19.0 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有試驗(yàn)結(jié)果數(shù)值均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。 選用單因素方差分析（ANOVA LSD），DUNCAN 多重比較和雙變量相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)結(jié)果

2.1.1 細(xì)胞活力檢測(cè)在測(cè)定TMPE 的抗炎活性前，先對(duì)TMPE 對(duì)細(xì)胞的影響進(jìn)行評(píng)估，表2 顯示與未經(jīng)處理的細(xì)胞對(duì)照組（0 質(zhì)量濃度）相比，不同質(zhì)量濃度的TMPE 對(duì)RAW264.7 作用不同。 在質(zhì)量濃度0.01～10 μg/mL 的TMPE 測(cè)試范圍內(nèi)觀察到的細(xì)胞存活率隨著劑量增加而增加，在TMPE 最大質(zhì)量濃度為100 μg/mL 的時(shí)候，細(xì)胞存活率與對(duì)照組相比會(huì)顯著降低（P＜0.05），該濃度的細(xì)胞存活率僅為62%。在TMPE 質(zhì)量濃度為0.1、1、10 μg/mL 時(shí)與對(duì)照組相比細(xì)胞存活率顯著增加（P＜0.05），在10 μg/mL 時(shí)TMPE 顯示出最高的存活率（172%）。

2.1.2 TMPE 對(duì)NO 生成的影響通過測(cè)試TMPE對(duì)NO 生成的抑制效果，驗(yàn)證TMPE 的抗炎活性，結(jié)果顯示如圖1。 從圖中可以確定LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞，NO 的生成量相比對(duì)照組顯著增加（P＜0.05），在LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞模型中加入不同質(zhì)量濃度的TMPE （0.01、0.1、1 μg/mL 和10 μg/mL），NO 的產(chǎn)生量相比LPS 模型組均顯著降低（P＜0.05）（抑制率分別是38.21%、64.17%、58.16%和79.42%）。SMT（強(qiáng)的iNOS 抑制劑）顯著地降低了LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞NO 產(chǎn)量（P＜0.05）（抑制率為45.24%）。

表2 不同質(zhì)量濃度下細(xì)胞存活率Table 2 Survival rate of cells at different concentration

圖1 不同處理下NO 的產(chǎn)量Fig. 1 Production of NO under different treatments

2.1.3 TMPE 對(duì)TNF-α 和IL-1β 的影響在LPS誘導(dǎo)的RAW264.7 炎癥模型中，檢測(cè)TMPE 對(duì)炎性因子TNF-α 和IL-1β 生成的抑制效果， 結(jié)果見圖2。由圖表明，LPS 誘導(dǎo)的模型組中，TNF-α 和IL-1β的質(zhì)量濃度均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），加入0.01、0.1、1、10 μg/mL 的TMPE 后均能顯著降低TNF-α（抑制率分別是27.91%、36.31%、36.14%、45.09%）和IL-1β 的產(chǎn)生 （抑制率分別是47.75%、58.47%、60.21%、64.55%）（P＜0.05）。 綜合細(xì)胞活力，NO 生成量實(shí)驗(yàn)和本實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 TMPE 的質(zhì)量濃度在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，確定為在10 μg/mL。

圖2 不同處理下TNF-α 和IL-1β 的質(zhì)量濃度Fig. 2 Contents of TNF- alpha and IL-1 beta under different treatments

圖3 mRNA 相對(duì)表達(dá)量Fig. 3 Expression levels of genes

2.1.4 基因表達(dá)量檢測(cè)用10 μg/mL 的TMPE 處理細(xì)胞基因mRNA 表達(dá)量見圖3，與空白組相比較LPS 模型組，相關(guān)炎癥基因（iNOS、COX-2、NF-κB、STAT3、HIF-1α）的表達(dá)量均顯著提高（P＜0.05），在LPS+TMPE（10 μg/mL）組中，相關(guān)炎癥基因的表達(dá)量除NF-κB基因外， 其他炎癥相關(guān)基因（iNOS、COX-2、STAT3、HIF-1α）的表達(dá)量與LPS 模型組均顯著降低（P＜0.05），iNOS、COX-2 和HIF-1α 基因的表達(dá)量仍然顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），其中STAT3的表達(dá)量降低程度比對(duì)照組的更低， 且差異顯著（P＜0.05）。

2.1.5 免疫印跡檢測(cè)結(jié)果用10 μg/mL 的TMPE處理細(xì)胞免疫印跡結(jié)果見圖4， 通過免疫印跡檢測(cè)TMPE 對(duì)炎癥相關(guān)蛋白質(zhì)（COX-2，NF-κB，STAT3，HIF-1α） 表達(dá)的影響，LPS 模型組與對(duì)照組相比炎癥相關(guān)蛋白質(zhì)（COX-2、NF-κB、STAT3、HIF-1α）的表達(dá)量均有所增加， 其中COX-2 和STAT3 的蛋白質(zhì)增加量最多，NF-κB 和HIF-1α 蛋白質(zhì)表達(dá)量增加次之。LPS+TMPE 組與LPS 模型組相比，除NF-κB蛋白質(zhì)變化不明顯， 其他蛋白質(zhì) （COX-2，STAT3，HIF-1α）的表達(dá)量均有降低，特別是STAT3 蛋白質(zhì)的表達(dá)量。在LPS+TMPE 組中STAT3 蛋白質(zhì)的表達(dá)量比對(duì)照組都低。

圖4 免疫印跡結(jié)果Fig. 4 Results of western blot

2.2 討論

食用菌種類繁多，營養(yǎng)豐富，富含各種氨基酸、脂肪酸、多糖等多種營養(yǎng)成分，口味豐美，同時(shí)具有增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、降血糖血脂等藥用功能[13-14]。野生蒙古口蘑稀有、綠色、純天然，倍受大家的追捧。 研究發(fā)現(xiàn)，蘑菇多糖提取物具有抗炎等多種藥理活性[15]，本實(shí)驗(yàn)通過LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞的炎癥模型， 質(zhì)量濃度在0.01～10 μg/mL 的TMPE 測(cè)試范圍內(nèi)觀察到的細(xì)胞存活率、NO 生產(chǎn)抑制率及炎性因子TNF-α 和IL-1β 生成的抑制效果隨著劑量增加而增加， 質(zhì)量濃度10 μg/mL 時(shí)TMPE 顯示出最高的細(xì)胞存活率（172%），NO 的最大抑制效果（45.24%），TNF-α 和IL-1β 生成最大的抑制效果（分別為58.47%、65.86%）。 蒙古口蘑多糖提取物有望成為新的抗炎藥物。

炎癥因子TNF-α 和IL-1β 的產(chǎn)生受轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 和STAT3 的調(diào)控[16]，NO 是由iNOS 和COX-2催化合成的，研究表明甲醇、乙醇提取不同蘑菇的多糖均可以抑制NO 的生成[17-18]，炎癥的發(fā)生與iNOS和COX-2 的過表達(dá)有關(guān)[19]，iNOS 和COX-2的表達(dá)受轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、STAT3 及HIF-1α 調(diào)控[20]， 抑制JAK2-STATs 活性會(huì)導(dǎo)致LPS 誘導(dǎo)的NO 產(chǎn)生及iNOS 的表達(dá)[21]，激活HIF-1α 通路會(huì)增加NO 的表達(dá)[22]。 本實(shí)驗(yàn)中選擇HIF-1α、NF-κB、STAT3、COX-2、iNOS 作為研究對(duì)象， 定量結(jié)果顯示，TMPE 會(huì)導(dǎo)致iNOS、COX-2、STAT3、HIF-1α 的表達(dá)量降低，免疫印跡結(jié)果顯示，TMPE 會(huì)導(dǎo)致COX-2、STAT3、HIF-1α 蛋白質(zhì)的表達(dá)量降低， 而NF-κB 的mRNA表達(dá)量及蛋白質(zhì)質(zhì)量均變化不明顯， 因此可以推斷TMPE 的抗炎作用主要通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子STAT3和HIF-1α 的表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)iNOS 和COX-2 的表達(dá)，而不主要通過轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 的變化發(fā)揮抗炎作用，也就是說TMPE 通過JAK-STAT3 及HIF-1α信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)抗炎的效果。

3 結(jié)語

通過LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞的炎癥模型，發(fā)現(xiàn)蒙古口蘑多糖提取物在不同濃度下具有不同質(zhì)量的抗炎活性， 通過對(duì)HIF-1α、NF-κB、STAT3、COX-2、iNOS基因及蛋白質(zhì)的表達(dá)確定蒙古口蘑多糖提取物主要通過JAK-STAT3 及HIF-1α 信號(hào)通路，而不主要通過NF-κB 信號(hào)通路，抑制炎癥因子TNF-α、IL-1β 和NO 的釋放，進(jìn)而發(fā)揮抗炎作用。