核酸酶酶解-高效液相色譜法分析DNA堿基組成*
——介紹一個綜合化學實驗

劉震 梁靚 竇鵬 卞寧生 柯曉康 章文偉

(南京大學化學化工學院 江蘇南京210093)

核酸酶酶解-高效液相色譜法分析DNA堿基組成*
——介紹一個綜合化學實驗

劉震 梁靚 竇鵬 卞寧生 柯曉康 章文偉

(南京大學化學化工學院 江蘇南京210093)

介紹一個分析化學與生物化學交叉的綜合化學教學實驗及其教學方案的設計思路。該實驗以高效液相色譜和核酸酶為工具，分析DNA的堿基組成。通過改革實驗教學設計，加深學生對各個知識點的理解與運用，培養(yǎng)學生分析問題和解決問題的能力。

DNA由腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)4種堿基組成。G+C的含量在生物化學、微生物學和分子生物學等領域具有重要意義，不同生物體中的DNA具有特定的(C+G)%值，DNA的熔解溫度(Tm，PCR擴增的重要參數)和DNA的均一性都與(C+G)%值緊密相關。高效液相色譜(HPLC)是現代分析實驗室必備的分析儀器;酶解反應是生物化學以及生命科學研究中的重要工具。利用核酸酶酶解－高效液相色譜分析法［1］，可以對DNA的堿基組成進行分析。該方法已經相當成熟［2］，并被國外教材采用為大學化學實驗［3］。但是，以往的實驗目的主要強調用HPLC法測定DNA的堿基組成，并測定Tm值。本實驗通過改革實驗教學方案與教學方式，對實驗內容和實驗要求進行了創(chuàng)新設計，能夠加深學生對實驗中各個知識點的理解與運用，同時可培養(yǎng)學生分析問題和解決問題的能力。

1 實驗原理

(1)核酸酶P1能水解單鏈DNA或RNA的3'－5'磷酸二酯鍵，將其定量降解為4種核苷酸，化學反應見圖1。但核酸酶P1不能水解雙鏈DNA。

(2)堿基配對原理:在DNA分子中，C通過氫鍵與G配對，A通過氫鍵與T配對。因此，C與G濃度相等，A與T濃度相等。

(3)將DNA的稀鹽溶液加熱到80～100℃，雙螺旋結構發(fā)生解體，變成兩條單鏈，這一過程稱為熱變性。DNA的變性發(fā)生在狹小的溫度范圍內，是個相變過程。通常把加熱變性使DNA的雙螺旋結構失去一半時的溫度稱為該DNA的熔點或熔解溫度，用Tm表示。DNA的Tm與其(G+C)含量成正比關系，(G+C)含量越高，Tm越高。這是因為G與C配對時形成3個氫鍵，而A與T配對時只形成2個氫鍵。(G+C)%與Tm間存在一個經驗關系［4］:

(4)DNA的復性:在適當的條件下，變性后的DNA的兩條彼此分開的鏈可以重新締合成為雙螺旋結構，這一過程稱為復性。經過熱變性后的DNA，若緩慢冷卻，可以復性;但若在冰浴中驟然冷卻，則不能復性。

圖1 核酸酶P1催化核酸的水解反應

(5)根據被測組分在流動相和固定相間相互作用強度的不同，可用HPLC將被測組分分離，與固定相相互作用弱的組分先流出色譜柱，與固定相相互作用強的組分后流出色譜柱。核苷酸的混合物可以采用離子交換色譜或反相色譜實現基線分離，本實驗采用反相HPLC。

(6)以鳥嘌呤脫氧核苷酸(dGMP，簡寫為G)為內標，根據標樣的峰面積利用歸一化法計算胞嘧啶脫氧核苷酸(dCMP，簡寫為C)，胸腺嘧啶脫氧核苷酸(dTMP，簡寫為T)，腺嘌呤脫氧核苷酸(dAMP，簡寫為A)的響應因子(F):

式中，AC、AG、AA、AT分別為C、G、A和T的峰面積，［C］、［G］、［A］、［T］分別為C、G、A和T的濃度。根據酶解后的DNA樣品的峰面積和相應的響應因子可計算出C、T、A的濃度，并計算(C+G)的分數:

2 實驗目的

讓學生進一步掌握高效液相色譜實際應用、學習酶解的實際操作，培養(yǎng)學生應用分析化學方法和生物化學知識解決實際問題的能力。

3 儀器與試劑

(1)高效液相色譜儀(紫外吸收檢測器，波長260nm)，反相色譜柱(C18)。

(2)恒溫水浴(室溫～100℃)。

(3)冰浴。

(4)未知DNA樣品:固體或1mg/mL水溶液(1mL)。

(5)核酸酶 P1:5units/mL溶于含0.5mmol/L ZnCl2的50mmol/L乙酸鈉緩沖溶液(pH 5.3)。

(6)核苷酸混合標樣，含dGMP、dAMP、dCMP和dTMP各0.4mmol/L。

(7)核苷酸單一標樣，分別含0.4mmol/L的dGMP、dAMP、dCMP或dTMP。

(8)流動相:含適量有機溶劑的10mmol/L磷酸鉀緩沖溶液，pH 7.2(有機溶劑的含量與色譜柱的品牌有關，一般為0～5%的甲醇或乙腈)。

4 實驗要求

現有一未知DNA樣品(對學生是未知的)，應用本實驗介紹的生物化學知識和本實驗提供的實驗條件，自行設計實驗方案，完成實驗并回答下列問題，要求實驗步驟數越少越好(運行1次HPLC分析為1個步驟，平行實驗視為1步):

(1)該樣品是單鏈DNA，雙鏈DNA，還是兩者的混合物?證據是什么?

(2)若該樣品中含有兩條單鏈DNA，如何證明這兩條單鏈是由原來互補的DNA雙鏈變性而來還是兩條不互補的單鏈DNA?

(3)測定該DNA樣品的(G+C)%，求算該DNA的溶解溫度(Tm)。

5 思考題

(1)計算相對濃度［C］/［G］、［T］/［G］和［A］/［G］。［C］/［G］的理論值應為多少?［T］/［G］和［A］/［G］間的理論關系是什么?

(2)對于相同的DNA，利用單鏈和雙鏈測得的(G+C)含量相同嗎?為什么?

(3)注意觀察在不同條件下得到的色譜圖，比較色譜圖的變化，是否觀察到一些同你的預期不符合的實驗結果或現象?若有，如何解釋?

6 教學設計特點

本實驗屬于分析化學與生物化學相結合的綜合化學實驗，在教學設計上主要有以下特點:

(1)教學內容“問題化”，易激發(fā)學生的興趣，使學生積極參與，成為實驗教學的主體。通過對分析化學和生物化學相關知識的主動認識與實際應用，建立起真正屬于學生自己的知識，并培養(yǎng)學生應用知識的能力。

(2)學生自行設計實驗方案，實驗內容由學生自己做主。學生在自行設計實驗方案時必須考慮實驗內容中的每一個步驟。同時，通過分組討論的方式，讓學生相互評價各自的實驗方案，最后由指導教師點評不同方案的共性、差異以及優(yōu)劣之處。在此基礎上，讓學生適當更改，制定出最終的實驗方案。在此過程中，指導教師只是點評、啟發(fā)與引導，并不要求學生的想法與教師完全一致。

(3)多個知識點的綜合運用。本實驗涉及到的知識點有:高效液相色譜法、歸一化法、核酸酶P1酶解原理、堿基配對原理、DNA的變性與復性、熔解溫度的估算等。在整個實驗中，學生需要多次綜合運用這些知識點才能設計出合格的實驗方案。在每一個實驗步驟中，學生至少可以運用到一個知識點，從而有效地培養(yǎng)了學生利用所學知識解決實際問題的能力。

(4)多角度、全方位的能力培養(yǎng)。單從HPLC的角度看，實驗內容僅涉及到定性分析與定量分析。但在整個實驗過程中，學生的活動包括設計、實驗、觀察、分析等多方面內容。此外，學生還將學會統(tǒng)籌分配實驗時間。

［1］ Katayama－Fujimura Y，Komatsu Y，Kuraishi H，et al.Agric Biol Chem，1984，48:3169

［2］ Wietstock SM.JChem Educ，1995，72:950

［3］ Harris D C.Quantitative Chemical Analysis.6th ed.New York:W.H.Freeman and Company，2002

［4］ 王鏡巖，朱圣庚，徐長法.生物化學.第3版.北京:高等教育出版社，2002

國家自然科學基金委國家基礎科學人才培養(yǎng)基金“南京大學理科化學基地(J0630425)”