高效液相色譜法測定飼料香味劑中香芹酚和百里香酚含量的研究

遼寧省獸藥飼料監(jiān)察所 楊希國 李永才

香芹酚和百里香酚是 《飼料添加劑品種目錄（2008）》（中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第1126號）規(guī)定的允許在養(yǎng)殖動物中使用的飼料香料劑。目前尚無檢測飼料香味劑中香芹酚和百里香酚的國家標準、行業(yè)標準及報道。本研究建立了飼料香味劑中香芹酚和百里香酚含量測定的高效液相色譜法，本方法操作簡便、準確可靠、選擇性好，為香味劑的檢測提供了技術(shù)支持。

1 試驗方法

1.1 儀器 Waters 2695型液相色譜儀 （配二極管陣列檢測器）；超聲波清洗器；電子天平（精度0.0001 g和 0.00001 g）。

1.2 試劑和溶液 冰醋酸、甲醇為色譜純；95%乙醇為分析純；香芹酚（Sigma公司，純度98%）；百里香酚（Sigma公司，純度99%）；流動相：甲醇+水+冰醋酸（60+40+2）；標準溶液：精密稱取香芹酚500 mg，置50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，制成濃度為10 mg/mL的香芹酚標準貯備液。精密稱取百里香酚500 mg，置50 mL容量瓶中，用95%乙醇溶解并稀釋至刻度，制成濃度為10 mg/mL的百里香酚標準貯備液。臨用前，將香芹酚標準貯備液和百里香酚標準貯備 液 用 甲 醇 稀 釋 成 濃 度 為 1.0、2.0、5.0、10.0、50.0、200.0 μg/mL 和 500.0 μg/mL 的 標 準 工 作液。

1.3 色譜條件 色譜柱：Waters Symmetry C18色譜柱（粒度為 5 μm，柱長 250 mm，內(nèi)徑 5 mm）；流速為0.7 mL/min；檢測波長為 274 nm；進樣體積為 20 μL；柱溫為 30 ℃。

1.4 樣品測定

1.4.1 樣品提取 稱取飼料香味劑樣品2 g（精確至0.0001 g），置于250 mL容量瓶中，加甲醇超聲提取30 min，定容，過0.45 μm的濾膜，供液相色譜測定。

1.4.2 樣品測定 取20 μL處理好的樣品注入高效液相色譜儀中，以保留時間定性，以峰面積外標法定量。

1.5 回收率及精密度測定 精密稱取飼料香味劑2 g，置于250 mL容量瓶中，添加香芹酚和百里香酚標準物質(zhì)，按1.4方法測定，計算回收率和精密度。

1.6 定量限測定 添加不同水平香芹酚和百里香酚的飼料香味劑，按1.4方法檢測，定量限以信噪比大于等于10（S/N≥ 10）計算。

2 結(jié)果

2.1 波長選擇 取0.1 mg/mL的香芹酚和百里香酚標準溶液進行波長掃描，結(jié)果在274.5 nm處有最大吸收波長（見圖1）。用274 nm檢測時無雜質(zhì)峰干擾，香芹酚和百里香酚能完全分離。

圖1 香芹酚和百里香酚波長掃描圖譜

2.2 色譜圖 標準溶液的液相色譜圖見圖2。圖2表明，香芹酚和百里香酚得到了很好的基線分離，峰形對稱，無雜質(zhì)峰干擾。

2.3 線性關(guān)系考察 配制濃度為 1.0、2.0、5.0、10.0、50.0、200.0 μg/mL 和 500.0 μg/mL 的香芹酚和百里香酚系列標準工作液后進行測定，結(jié)果香芹酚標準曲線為Y=23600X+7664.8，百里香酚標準曲線為Y=23787X+7740.1，相關(guān)系數(shù)均大于0.9999，結(jié)果表明，香芹酚和百里香酚在1.0～500.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 回收率和精密度測定結(jié)果 對某樣品進行了11次測定，結(jié)果香芹酚和百里香酚的平均含量分別為23.5 mg/g和22.8 mg/g。對該樣品進行了添加回收率實驗。稱取2 g樣品，加入5 mg香芹酚和百里香酚，結(jié)果見表1。測得香芹酚的回收率為96.8% ～99.2%，平均回收率為98.2%，變異系數(shù)為1.0%；百里香酚的回收率為97.6%～101.4%，平均回收率為99.5%，變異系數(shù)為1.6%，該方法回收率高、重現(xiàn)性好。

2.5 定量限測定結(jié)果 添加不同水平香芹酚和百里香酚的飼料香味劑，按上述方法檢測，當添加水平為50 mg/kg時，其信噪比均大于10（S/N>10），因此，確定方法的定量限為50 mg/kg。

表1 香芹酚和百里香酚的添加回收率和精密度

3 討論

3.1 提取 香芹酚和百里香酚均能溶于醇、醚和堿溶液等，不溶或微溶于水。本研究分別考察了甲醇、無水乙醇和95%乙醇對飼料香味劑中香芹酚和百里香酚的超聲提取效果，結(jié)果表明無水乙醇和95%乙醇提取的回收率相仿，略低于甲醇提取的回收率。超聲時間30 min以上提取效果幾乎無變化。故選甲醇超聲提取30 min為樣品提取方法，此方法回收率高，樣品雜質(zhì)少，對檢測無干擾。

3.2 檢測條件 香芹酚和百里香酚屬同分異構(gòu)體，其沸點相差約5℃，氣相色譜分離較難；本研究采用高效液相色譜法Symmetry C18色譜柱分離，紫外檢測器檢測，考察了甲醇+水+冰醋酸（60+40+2）和乙腈+水（65+35）作為流動相的檢測效果，結(jié)果顯示乙腈和水作為流動相色譜峰的對稱性差，而甲醇、水和冰醋酸混合作為流動相香芹酚和百里香酚得到了很好的基線分離，峰形對稱，無雜質(zhì)干擾。

4 結(jié)論

高效液相色譜法檢測飼料香味劑香芹酚和百里香酚，具有線性關(guān)系良好、回收率高、變異小的特點，對飼料香味劑香芹酚和百里香酚定量分析準確可靠，可以推薦用于飼料香味劑中香芹酚和百里香酚的檢測。