新飼料添加劑對(duì)百里香酚的開發(fā)和應(yīng)用研究

■彭險(xiǎn)峰 易家紅 肖 燦

（廣州英賽特生物技術(shù)有限公司，廣東廣州 510663）

1946年首次報(bào)道了鏈霉素可刺激雛雞生長(zhǎng)[1]，1950年美國食品與藥物管理局首次批準(zhǔn)抗生素用作飼料添加劑。此后，抗生素作為飼料添加劑被大范圍的推廣和應(yīng)用，從而導(dǎo)致了細(xì)菌耐藥性、食品動(dòng)物產(chǎn)品中殘留和環(huán)境污染及危害人的健康等問題[2-3]。歐盟已于2006年開始全面禁止在飼料中使用抗生素作為動(dòng)物生長(zhǎng)促進(jìn)劑[4]，許多國家或地區(qū)也在推進(jìn)禁用促生長(zhǎng)抗生素。因此，有效的抗生素替代產(chǎn)品的研究開發(fā)正成為飼料添加劑工業(yè)發(fā)展的一個(gè)重要方向。對(duì)百里香酚為百里香酚的同分異構(gòu)體，化學(xué)名為3-甲基-4-異丙基苯酚，分子式為C10H14O，分子量為150.218，熔點(diǎn)112℃，不溶于水，易溶于乙醇、甲醇等有機(jī)溶劑。研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)百里香酚比百里香酚有更強(qiáng)的抗菌活性、更低的揮發(fā)性、更高的安全性、具有更好的適口性及促生長(zhǎng)效果。試驗(yàn)研究對(duì)百里香酚對(duì)大鼠的急性毒性、體外抗菌活性及肉雞飼養(yǎng)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

對(duì)百里香酚，純度≥98%，批號(hào)20130806，由廣州英賽特生物技術(shù)有限公司提供。百里香酚、香芹酚購自Sigma公司，分析純。金霉素為市售預(yù)混劑，含量15%。

培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基、TSB液體培養(yǎng)基、FT培養(yǎng)基，由廣東環(huán)凱生物科技有限公司提供。

測(cè)試菌株：大腸桿菌159、大腸桿菌020、大腸桿菌147、雞傷寒沙門氏菌206、鴨沙門氏菌118、豬霍亂沙門氏菌141、金黃色葡萄球菌871、金黃色葡萄球菌810、金黃色葡萄球菌837、產(chǎn)氣莢膜梭菌859、產(chǎn)氣莢膜梭菌795、產(chǎn)氣莢膜梭菌591，由廣州英賽特生物技術(shù)有限公司分離鑒定并保存。

試驗(yàn)動(dòng)物及飼料：Wistar大鼠，購自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重150～180 g，雌、雄各半，自由采食和飲水，飼料為不含任何藥物的全價(jià)料。嶺南黃快大肉雞，由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所種雞場(chǎng)提供；102型肉雞飼料（不含抗生素），廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 體外抗菌活性試驗(yàn)

凍干菌種按菌種恢復(fù)培養(yǎng)方法[5]恢復(fù)培養(yǎng)，采用試管二倍稀釋法[6]測(cè)定對(duì)百里香酚對(duì)雞傷寒沙門氏菌、鴨沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、大腸桿菌、金色葡萄球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌的體外最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC），并比較百里香酚及香芹酚的抗菌活性差異。

1.2.2 經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)

采用簡(jiǎn)化寇氏法[7]進(jìn)行大鼠急性毒性試驗(yàn)。動(dòng)物在飼養(yǎng)觀察3 d后選用體重相近的健康大鼠進(jìn)行預(yù)試，測(cè)定對(duì)百里香酚、百里香酚和香芹酚大鼠死亡率在0～100%的劑量范圍分別為4 000～8 000、500～1 200、500～1 400 mg/(kg·bw)。選用體重相近的健康大鼠隨機(jī)分成15組，每組10只，雌、雄各半，分別灌服不同劑量的對(duì)百里香酚、百里香酚及香芹酚。連續(xù)觀察7 d，記錄大鼠的中毒表現(xiàn)及死亡情況。根據(jù)試驗(yàn)各組死亡率結(jié)果計(jì)算其LD50及95%可信限。

1.2.3 肉雞的飼養(yǎng)試驗(yàn)

1.2.3.1 不同劑量對(duì)百里香酚對(duì)肉雞的促生長(zhǎng)效果試驗(yàn)

試驗(yàn)設(shè)20、50、100、500 mg/kg 4個(gè)劑量組及一個(gè)空白對(duì)照組，250只肉雞隨機(jī)分成5組，每組50只。飼養(yǎng)21 d后統(tǒng)計(jì)各組試驗(yàn)雞的存活率、增重及料肉比。

1.2.3.2 對(duì)百里香酚、百里香酚及金霉素對(duì)肉雞促生長(zhǎng)比較試驗(yàn)

600只肉雞隨機(jī)分成4組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)50只。各試驗(yàn)組分別在飼料中添加100 mg/kg的對(duì)百里香酚、百里香酚及50 mg/kg的金霉素，空白對(duì)照組不加任何藥物，飼養(yǎng)21 d后統(tǒng)計(jì)各組的增重及料肉比。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外抗菌活性試驗(yàn)結(jié)果

肉眼觀察有無細(xì)菌生長(zhǎng)，陽性可見混濁生長(zhǎng)，陰性可見澄清。對(duì)百里香酚對(duì)大腸桿菌、沙門氏桿菌、金色葡萄球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌最小抑菌濃度（MIC）均為100 μg/ml，且抗菌活性較百里香酚和香芹酚強(qiáng)1～2倍，結(jié)果見表1。

表1 對(duì)百里香酚、百里香酚及香芹酚的抗菌活性比較研究結(jié)果（MIC，μg/ml）

2.2 急性毒性試驗(yàn)結(jié)果（見表2）

表2 對(duì)百里香酚、百里香酚及香芹酚對(duì)大鼠的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)百里香酚、百里香酚和香芹酚對(duì)大鼠的LD50分別為6 174.9、835.4、968.1 mg/(kg·bw)，95%可信限分別為5 701.4～6 687.8、764～913.3、878.8～1 066.4 mg/(kg·bw)，結(jié)果顯示，對(duì)百里香酚比百里香酚和香芹酚的安全性分別提高約7倍和6倍。

2.3 肉雞的飼養(yǎng)試驗(yàn)

2.3.1 不同劑量對(duì)百里香酚對(duì)肉雞的促生長(zhǎng)試驗(yàn)結(jié)果（見表3）

表3 不同劑量的對(duì)百里香酚對(duì)肉雞促生長(zhǎng)試驗(yàn)的結(jié)果

雞飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果表明，各組均未出現(xiàn)動(dòng)物死亡，存活率均為100%，且不同劑量的對(duì)百里香酚對(duì)肉雞均有促生長(zhǎng)作用。與空白對(duì)照組相比，各試驗(yàn)組的相對(duì)增重率提高了4.66～7.39個(gè)百分點(diǎn)，且與添加量呈正相關(guān)。此外，添加對(duì)百里香酚的試驗(yàn)組還能不同程度地改善飼料報(bào)酬，與空白對(duì)照組相比，料肉比降低0.061～0.108。

2.3.2 對(duì)百里香酚、百里香酚及金霉素對(duì)肉雞促生長(zhǎng)的比較試驗(yàn)結(jié)果（見表4）

表4 對(duì)百里香酚、百里香酚及金霉素對(duì)肉雞促生長(zhǎng)的比較試驗(yàn)結(jié)果

在飼料中分別添加各100 mg/kg的對(duì)百里香酚、百里香酚或50 mg/kg的金霉素后，與空白對(duì)照組相比，對(duì)百里香酚有明顯的促生長(zhǎng)作用，相對(duì)增重率提高6.73個(gè)百分點(diǎn)，平均料肉比降低0.096；而百里香酚和金霉素試驗(yàn)組的相對(duì)增重率僅分別提高2.69個(gè)百分點(diǎn)和4.11個(gè)百分點(diǎn)，平均料肉比分別降低0.037和0.054，其促生長(zhǎng)效果低于對(duì)百里香酚試驗(yàn)組。

3 小結(jié)

從對(duì)百里香酚、百里香酚和香芹酚對(duì)4種常見細(xì)菌的抗菌活性可見，對(duì)百里香酚對(duì)革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌）和革蘭氏陰性細(xì)菌（大腸桿菌和沙門氏菌）均有抗菌活性，最小抑菌濃度為100 μg/ml，優(yōu)于百里香酚和香芹酚。大鼠急性中毒時(shí)，其主要癥狀腹瀉的程度與給藥劑量有關(guān)，即有劑量效應(yīng)關(guān)系，隨著劑量的增加，腹瀉程度加重，動(dòng)物的死亡均因腹瀉引起的脫水、衰竭所致。最初排出的糞便呈乳白色（對(duì)百里香酚的顏色）油狀，腹瀉重癥在第2～4 d死亡，輕癥可達(dá)7 d之久，耐過者逐漸恢復(fù)正常。致瀉原因是給藥劑量較大，造成胃擴(kuò)張，引起消化、吸收不良；同時(shí)對(duì)百里香酚不溶于水，用玉米油制成混懸液，過量的玉米油也可引起腹瀉。對(duì)百里香酚對(duì)大鼠的LD50為6 174.9 mg/(kg·bw)，按化合物經(jīng)口急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)屬相對(duì)無毒級(jí)范疇[相對(duì)無毒大鼠口服LD50為5 000～ 50 000 mg/(kg·bw)][8]。

腸道微生物的組成受飼糧成分的影響，而腸道微生物又可通過影響?zhàn)B分的利用和胃腸道系統(tǒng)的發(fā)育來影響宿主的營養(yǎng)、健康和生長(zhǎng)，這種相互作用十分復(fù)雜。對(duì)百里香酚通過破壞細(xì)菌細(xì)胞膜pH值穩(wěn)態(tài)和無機(jī)離子平衡，導(dǎo)致細(xì)菌死亡。本研究的肉雞促生長(zhǎng)試驗(yàn)結(jié)果表明，在飼料中添加100 mg/kg的對(duì)百里香酚能顯著提高相對(duì)增重率和降低料肉比，優(yōu)于添加100 mg/kg的百里香酚和50 mg/kg的金霉素。

試驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)百里香酚比百里香酚和香芹酚的抗菌活性提高了1～2倍，安全性提高了6～7倍，促生長(zhǎng)效果明顯優(yōu)于百里香酚和金霉素，因此，對(duì)百里香酚作為促生長(zhǎng)添加劑可替代金霉素。