基于殼聚糖-硅溶膠復(fù)合膜固載甲苯胺藍(lán)及納米金的新型電流型過氧化氫生物傳感器的研究

孫 妮，李文娟，袁 若,柴雅琴

（西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶市分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400715）

0 引言

在生物傳感器的構(gòu)建中，關(guān)鍵技術(shù)之一就是如何將生物活性分子穩(wěn)定、高活性地固定到電極表面[1～2]。殼聚糖（CS）是一種天然多糖，具有生物降解性、無毒性及良好的生物兼容性[3]等諸多優(yōu)點(diǎn)，在生物傳感器中已經(jīng)被廣泛用做酶的固載基質(zhì)[4～6]。在該實(shí)驗(yàn)中，用一種硅烷偶合試劑氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）交聯(lián)殼聚糖，形成的雜化復(fù)合材料可以克服純粹溶膠凝膠衍生的硅酸鹽材料的脆度和皺縮度，而且可以提供一個(gè)適中的疏水環(huán)境以便染料分子的固定，并且允許分析物透過該材料[7]。同時(shí)酶可以包裹到復(fù)合材料中而無需共價(jià)結(jié)合，因此可以保持其良好的生物活性。

然而，殼聚糖復(fù)合膜導(dǎo)電性差，這是其在生物傳感器應(yīng)用中的一個(gè)重要問題。鑒于納米材料優(yōu)異的電子傳輸能力，可以采用納米材料包括納米顆粒、納米管、量子點(diǎn)和納米線等來提高殼聚糖復(fù)合膜的導(dǎo)電性。由于納米金具有易制備、生物兼容性好，比表面積大和能提供一個(gè)與酶蛋白本身相似的環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被用來固載葡萄糖氧化酶[8]、辣根過氧化氫酶[9]和抗體[10]，同時(shí)保持這些生物大分子的活性。故該實(shí)驗(yàn)中，選擇納米金（GNPs）來改變其導(dǎo)電性。

在該實(shí)驗(yàn)中，嘗試聯(lián)合殼聚糖/硅溶膠凝膠復(fù)合物（CSHMs）和納米顆粒的優(yōu)點(diǎn)來研究酶的電化學(xué)和電催化性能。納米金用來改變導(dǎo)電性，甲苯胺藍(lán)作為電子媒介體，殼聚糖復(fù)合膜作為生物分子的固載基質(zhì)，Nafion用來防止酶和甲苯胺藍(lán)的泄露。選用辣根過氧化氫酶為模板酶蛋白，將其混入CSHMs-TB-GNPs溶液中，并將其滴涂在玻碳電極上，制備了Nafion/CSHMs-TB-GNPs-HRP/GCE生物傳感器。利用紫外吸收光譜分析修飾膜的組成，用循環(huán)伏安和計(jì)時(shí)電流法表征傳感器性能。該實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的傳感器對(duì)過氧化氫響應(yīng)快，為生物傳感器的發(fā)展提供了一個(gè)有前途的平臺(tái)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

CHI 660A型電化學(xué)工作站（上海辰華儀器公司），電化學(xué)反應(yīng)池為三電極體系：修飾了酶膜的玻碳電極為工作電極，鉑絲電極為對(duì)電極，飽和甘汞電極（SCE）為參比電極。Lambda 17 UV-VIS 8500(PE Co，USA)紫外分光光度計(jì) （300～750 nm）。GNPs的粒徑由H-600透射電子顯微鏡(TEM,日立公司)測(cè)定。辣根過氧化物酶（HRP，250 U/mg），氨丙基三乙氧基硅烷，殼聚糖，Nafion，氯金酸和檸檬酸鈉均購自美國Sigma公司，甲苯胺藍(lán)購自上海化學(xué)試劑公司，H2O2（30%,水溶液）購自重慶化學(xué)試劑公司，其它試劑均為分析純?cè)噭?，?shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。用檸檬酸鈉還原氯金酸水溶液制備納米金（粒徑約為 16 nm）[11]。

1.2 酶電極的制備

玻碳電極（GCE，φ =4 mm）依次用 0.3 μm、0.05 μm的Al2O3粉末進(jìn)行拋光。拋光后所得電極依次用乙醇、二次蒸餾水進(jìn)行超聲清洗5 min。

將 APTES與 0.1%的 CS在 HCl的作用下，在室溫條件下交聯(lián)反應(yīng) 2 h，即制得CSHMs。取 10 μL CSHMs 儲(chǔ)備液， 10 μL HRP（pH7.0，2 mg/mL HRP），10 μL GNPs 及 5 μL 1.0 mmol/L 的TB充分混合。然后取8 μL該混合液滴涂在潔凈的玻碳電極表面，在冰箱放置過夜成膜，取出后用PBS沖洗，放置晾干，然后在電極表面滴涂2.0 μL 0.25%Nafion 封閉 CSHMs-TB-GNPs-HRP 膜層，最終制得Nafion/CSHMs-TB-GNPs-HRP/GCE修飾電極。修飾好的電極置于冰箱(4℃)中保存。

按照同樣的方法制備對(duì)比實(shí)驗(yàn)所需的Nafion/HRP-TB-CSHMs/GCE修飾電極和Nafion/GNPs-TB-CSHMs/GCE修飾電極。圖1為電極制備示意圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外吸收光譜

圖2 所示是 （a）CS 溶液，（b） 硅溶膠，（c）CSHMs，（d）GNPs，（e）GNPs 和 CSHMs 的混合溶液，（f）HRP，GNPs和 CSHMs 的混合溶液的紫外吸收光譜圖。 從（a）（b）（c）可以看出，當(dāng)將 CS 溶液加入硅溶膠后，峰形幾乎沒有變化，表明在CS溶液中硅溶膠可以保持其化學(xué)性能不變。曲線（d）在524nm處有一處強(qiáng)吸收峰，該峰為GNPs的特征吸收峰。當(dāng)GNPs與CSHMs混合后的曲線（e）表明GNPs和CSHMs之間發(fā)生了相互作用[12]，并且使GNPs的表面發(fā)生了變化，從而引起光譜圖上的變化。HRP加入GNPs和CSHMs的混合溶液中以后（f），在大約416 nm處有一個(gè)強(qiáng)烈的吸收峰，此峰是HRP的特征吸收峰，表明在混合溶液中HRP可以保持其本身的結(jié)構(gòu)和生物活性。從圖2可以得到以下結(jié)論：CSHMs、GNPs及HRP可以彼此混合，并且保持它們各自的化學(xué)性能，為實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)備工作提供了可行性依據(jù)。

圖1 電極制備示意圖Fig.1 Schematic illustration of the preparation process of enzyme electrode

圖2 紫外吸收光譜圖Fig.2 UV-Vis absorption spectra of(a)CS solution,(b)sol-gel solution,(c)CSHMs,(d)GNPs,(e)CSHMs mixed with GNPs,(f)CSHMs mixed with HRP and GNPs

2.2 掃速對(duì)修飾電極性能的影響

圖3是修飾電極在pH7.0 PBS中，不同掃速下的循環(huán)伏安圖。從圖中可以看出，該傳感器的循環(huán)伏安表征呈現(xiàn)一對(duì)可逆的氧化還原峰，表明摻雜在CSHMs復(fù)合膜中的TB有效的固定在了玻碳電極表面，促進(jìn)了電子的傳輸。且在10～500 mV/s掃速范圍內(nèi)，氧化還原峰電流與掃速成線性關(guān)系，表明該修飾電極在PBS中的電化學(xué)過程是受表面控制的。

圖3 掃速對(duì)生物傳感器的影響Fig.3 CVs of the biosensor at various scan rates(from inner to outer curves:10,20,50,80,100,150,200,250,300,350,400,450,500 mV/s)in 0.1 mol/L pH7.0 PBS.The inset shows the linear relationship of peak currents and scan rates

2.3 修飾電極的電化學(xué)特征

圖4是該生物傳感器 （Nafion/HRP-GNPs-TB-CSHMs/GCE）在 pH7.0 PBS 中，加入不同濃度H2O2時(shí)的循環(huán)伏安圖。（a）為修飾電極在未加入H2O2時(shí)的循環(huán)伏安圖。當(dāng)加入0.35 mmol/L H2O2后，電極的催化還原電流明顯增大(曲線b)，加入1.05 mmol/L H2O2后，催化還原電流繼續(xù)增大(曲線c)，表明固載在CSHMs膜上的TB是一種有效的電子媒介體，可以在HRP生物活性中心與電極表面?zhèn)鬏旊娮?，同時(shí)還表明CSHMs復(fù)合膜可以保持HRP的生物活性。

圖4 Nafion/HRP-GNPs-TB-CSHMs/GCE修飾電極對(duì)H2O2的催化反應(yīng)圖Fig.4 CVs of the biosensor at scan rate of 100 mV/s in 0.1 mol/L PBS(pH7.0)without H2O2(a),with 0.35 mmol/L H2O2(b)and 1.05 mmol/L H2O2(c)

2.4 對(duì)比實(shí)驗(yàn)

圖5是在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，當(dāng)連續(xù)加入不同濃度H2O2時(shí)，不同的修飾電極對(duì)H2O2的電流-時(shí)間曲線。其中 (a)Nafion/GNPs-TB-CSHMs/GCE，（b）Nafion/HRP-TB-CSHMs/GCE，（c）Nafion/HRPGNPs-TB-CSHMs/GCE。從圖中可以看出（a）Nafion/GNPs-TB-CSHMs/GCE對(duì)H2O2幾乎沒有發(fā)生催化還原反應(yīng)。（b）Nafion/HRP-TB-CSHMs/GCE修飾電極有微小的電流響應(yīng)，表明電子媒介體TB在電極表面和HRP生物活性中心進(jìn)行了電子的傳遞。比較這3支修飾電極的電流響應(yīng)，（c）Nafion/HRP-GNPs-TB-CSHMs/GCE 電流響應(yīng)最靈敏，并且響應(yīng)電流遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于另外兩支修飾電極，表明納米金能大大的促進(jìn)電子轉(zhuǎn)移，進(jìn)而提高靈敏度。此外，納米金具有生物相容性，酶可以穩(wěn)固的吸附在納米金的表面。另外，固載了納米金的CSHMs復(fù)合膜呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可以增加酶的吸附量，增強(qiáng)傳感器的響應(yīng)。

圖5 不同修飾電極對(duì)H2O2的電流響應(yīng)Fig.5 The chronoamperometry response at applied potential of-0.4 V with injection of 3.5×10-4mol/L H2O2 into 5mL of stirring pH7.0 PBS for(a)Nafion/GNPs-TBCSHMs/GCE,(b)Nafion/HRP-TB-CSHMs/GCE and(c)Nafion/HRP-GNPs-TB-CSHMs/GCE modified electrode,respectively

2.5 傳感器對(duì)過氧化氫的電化學(xué)響應(yīng)

圖6是在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，Nafion/HRPGNPs-TB-CSHMs/GCE修飾電極的電流響應(yīng)圖及相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。從圖中可以看出，H2O2濃度在 7.0×10-7～2.3×10-3mol/L（r=0.998）范圍 內(nèi)與 其還原峰電流成良好的線性關(guān)系，檢出限為2.4×10-7mol/L(信噪比 3)。

2.6 傳感器的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性及選擇性

該酶修飾電極對(duì)濃度 0.02 mmol/L的 H2O2平行測(cè)定10次，所得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 （RSD）為3.4%，說明此酶生物傳感器重現(xiàn)性良好。將該酶生物傳感器在4℃的冰箱中放置1周后對(duì)相同濃度的底物響應(yīng)可保持為初始時(shí)的90%，4周后可保持81%，說明此電極穩(wěn)定性良好。

該實(shí)驗(yàn)考察了可能對(duì)此生物傳感器工作存在干擾的物質(zhì)如L-賴氨酸、L-亮氨酸、葡萄糖、乳酸、和乙醇等，發(fā)現(xiàn)均無明顯干擾，說明此H2O2生物傳感器具有較好的選擇性。這些應(yīng)當(dāng)歸功于Nafion膜對(duì)電活性物質(zhì)有良好的抗干擾能力。

3 結(jié)論

該實(shí)驗(yàn)成功制備了一種新型的過氧化氫生物傳感器。實(shí)驗(yàn)證明，CSHMs復(fù)合膜可以有效的將電子媒介體和酶固定到電極表面。與Nafion/GNPs-TB-CSHMs/GCE和Nafion/HRP-TBCSHMs/GCE修飾電極相比，Nafion/HRP-GNPs-TB-CSHMs/GCE修飾電極響應(yīng)電流靈敏度較高，線性范圍寬，檢測(cè)下限低，具有良好的選擇性，重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。

圖6 生物傳感器對(duì)連續(xù)加入不同濃度H2O2的計(jì)時(shí)安培電流圖Fig.6 Amperometric response of the biosensor to H2O2at-0.4 V upon successive additions of 1.4 μmol/L(110～190 s),7.0 μmol/L(230～310 s),14.0 μmol/L(350～430 s),35.0 μmol/L(470～550 s),70.0 μmol/L(590～670 s),140 μmol/L(710～830 s),350 μmol/L(870～990)in the time intervals of 40 s

[1]Zhang S，Wright G，Yang Y.Materials and techniques for electrochemical biosensor design and construction[J].Biosens Bioelectron，2000，15(5-6)：273～282.

[2]Wu X J，Choi M M F.Spongiform immobilization architecture of ionotropy polymer hydrogel coentrapping alcohol oxidase and horseradish peroxidase with octadecylsilica for optical biosensing alcohol in organic solvent[J].Anal Chem，2004，76(15)：4 279～4 283.

[3]Schulz B， Riedel A， Abel P V.Amperometric glucose biosensor based on situ electropolymerized polyaniline/poly(acrylonitrile-co-acrylic acid)composite film[J].J Mol Cat B，1999，7(2):85～87.

[4]Puig-Lleixa C， Jimenez C， Bartroli J.Acrylated polyurethane-photopolymeric membrane for amperometric glucose biosensor construction[J].Sens Actuators Chem，2001，72(1)：56～62.

[5]Wang B，Zhang J， Cheng G，et al.Amperometric enzyme electrode for the determination of hydrogen peroxide based on sol-gel/hydrogel composite film[J].Anal Chim Acta，2000， 407(1-2)：111～118.

[6]Kros A， Gerritsen M， Sprakel V S I， et al.Silica-based hybrid materiak as biocompatible coatings for glucose sensors[J].Sens Actuators，2001，81：68～75.

[7]Jaafar A，Musa A，Lee Y H， et al.Chitosan-based tyrosinase optical phenol biosensor employing hybrid nafion/sol-gel silicate for MBTH immobilization[J].Talanta，2006，70(2)：527～532.

[8]Zhang S，Wang N，Niu Y，et al.Immobilization of glucose oxidase on gold nanoparticles modified Au electrode for the construction of biosensor[J].Sens Actuat B，2005，109(2)：367～374.

[9]Gu H Y，Yu A M，Chen H Y.Direct electron transfer and characterization of hemoglobin immobilized on a Au colloid-cysteamine-modified gold electrode[J].J Electroanal Chem，2001，516(1/2)：119 ～ 126.

[10]Wang M，Wang L，Wang G，et al.Application of impedance apectroscopy for monitoring colloid Au-enhangced antibody immobilization and antibody-antigen reaction[J].Biosens Bioelectron，2004，19(6)：575～582.

[11]Garbar K C，Griffith F R，Hommer M B，et al.Preparation and Characterization of Au Colloid Monolayers[J].Anal Chem，1995，67：735～743.

[12]Lei C X,Hu S Q,Shen G L,et al.Immobilization of horseradish peroxidase to a nano-Au monolayer modified chitosan-entrapped carbon paste electrode for the detection of hydrogen peroxide [J].Talanta,2003,59：981 ～988.