散血明目片對兔視網(wǎng)膜靜脈阻塞熱休克蛋白70表達的影響

彭清華 ，葉群如 ，張波濤 ，姚小磊 ，譚涵宇 ，曾志成 ，韓 琦

（1.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院眼科學重點學科，湖南 長沙 410007；2.湖南省桂陽縣人民醫(yī)院眼科，湖南 桂陽 424400；3.遼寧省沈陽市第一人民醫(yī)院眼科，遼寧 沈陽 110041）

視網(wǎng)膜靜脈阻塞（retinal vein occlusion，RVO）是最常見的視網(wǎng)膜血管疾病[1]。由于其發(fā)病的多因性，目前尚無針對病因的確切有效的治療方法。散血明目片有活血通脈利水明目之功效，以往研究證實其對玻璃體積血等眼底出血患者有較好的臨床療效[2-3]。本研究采用激光造模法致兔視網(wǎng)膜靜脈阻塞，同時用活血通脈利水明目之散血明目片混懸液灌胃，然后采用免疫組織化學染色法檢測兔視網(wǎng)膜組織中熱休克蛋白70（HSP70）含量，并對其保護機制進行初步探討。現(xiàn)將實驗方法及結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 有色家兔36只(72只眼)，由湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供，雌雄不限，體質(zhì)量2.0～2.5 kg。

1.1.2 藥物 散血明目片：由三七、酒大黃、蒲黃、豬苓、防己、地龍、白茅根、澤瀉等活血通脈利水明目中藥按現(xiàn)代制劑制備工藝制成，0.3 g/片，選用同一批號藥物，批號：020624。由湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥劑科提供。使用時研成粉末，溫開水混合，濃度為100 mL含散血明目片12 g的混懸液。

1.1.3 試劑 HSP70免疫組化試劑盒，由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.1.4 儀器 SL-1E裂隙燈顯微鏡，日本托普康公司生產(chǎn)；直接檢眼鏡，英國Keeler公司生產(chǎn)；YZ13三面鏡，蘇州醫(yī)療器械廠生產(chǎn)；萊特眼底激光治療儀，法國光太公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 分組方法及RVO動物模型的建立 將36只家兔（72只眼）隨機分為3組，每組12只（24只眼）。分別為：健康空白組、模型組、散血明目片組。模型組和散血明目片組兩組實驗兔術(shù)前12 h禁食禁水，造模前每只家兔交替點10 g/L阿托品和托品卡胺充分擴瞳，先做正常眼底彩色照相及熒光素眼底血管造影。參照周正申等[4]介紹的激光光凝視網(wǎng)膜中央靜脈造模法制造RVO動物模型。10 g/L地卡因雙眼角膜表面麻醉后，通過三面鏡應用氬蘭-綠激光（488，514 nm）直接光凝視網(wǎng)膜靜脈上、下主干。初次光凝能量選擇280～340 mW，光凝點數(shù)依具體情況而定，曝光時間0.1 s，光斑直徑100 μm。激光光凝封閉靜脈時準確聚焦于靜脈，避免損傷鄰近的動脈。光凝封閉的靜脈段長度約1 DD，直至被封閉的靜脈段變細發(fā)白，血流停滯，其遠端迂曲擴張。光凝時由遠端向近端照射，以免光凝處靜脈內(nèi)壓力過高而破裂，影響操作。激光光凝封閉視網(wǎng)膜靜脈后，即作眼底彩色照相及熒光素眼底血管造影（FFA），觀察血管閉塞情況，若閉塞不完全則補充光凝封閉。一般情況下補充光凝1次就足夠，過度光凝封閉視網(wǎng)膜靜脈上下主干，往往可造成過于強烈的組織反應，從而使視網(wǎng)膜壞死。24 h后再復查FFA，證實視網(wǎng)膜靜脈上、下主干完全阻塞。

1.2.2 給藥方法 造模后2 d開始給藥，健康空白組與模型組以生理鹽水5 mL/kg灌胃；散血明目片組以散血明目片混懸液5 mL/kg灌胃。連續(xù)灌胃2周，1次/d。

1.2.3 免疫組化的檢測 分別于造模后3、7、14 d以空氣栓塞法處死動物，即刻摘取眼球，4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片（4 μm），作免疫組化ABC染色，以平均光密度值（OD）作為定量分析的指標。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理實驗數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)均采用“±s”表示，先進行正態(tài)性及方差齊性檢驗，若呈正態(tài)分布，方差齊，采用單因素方差分析，各組均數(shù)間的兩兩比較采用最小顯著性差異(Least significant diference，LSD)檢驗法，方差不齊則采用近似檢驗（Dunnett’s T3）。

2 結(jié)果

散血明目片對視網(wǎng)膜組織中HSP70陽性表達的平均光密度值（OD）的影響如表1所示：造模后3 d，散血明目片組及模型組HSP70陽性表達明顯增強，兩組與空白組比較差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），但散血明目片組與模型組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。造模后7 d，散血明目片組及模型組HSP70陽性表達較第3天時降低，但各組間比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。造模后14 d，散血明目片組及模型組HSP70陽性表達進一步降低，但散血明目片組較空白組仍明顯增高，散血明目片組與模型組及空白組間比較差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），而模型組與空白組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1 各組兔視網(wǎng)膜HSP70陽性表達的平均光密度值 （±s）

表1 各組兔視網(wǎng)膜HSP70陽性表達的平均光密度值 （±s）

注：與空白組比較▲P<0.01；與模型組比較◆P<0.01。

組 別空白組模型組散血明目片組14 d 0.277±0.020 0.305±0.021 0.461±0.042▲◆眼數(shù)（只）888 3 d 0.273±0.022 0.735±0.074▲0.729±0.045▲7 d 0.260±0.052 0.428±0.028▲0.617±0.059▲◆

3 討論

視網(wǎng)膜靜脈阻塞屬中醫(yī)“絡(luò)損暴盲”范疇，我們認為該病是眼科典型的血瘀證候，本病存在著眼血液動力障礙、血液流變性異常、血小板聚集及全身微循環(huán)障礙等血瘀改變。而且本病的臨床特征就是視網(wǎng)膜的分支或中央靜脈阻塞后，使脈中血液運行受阻，溢于脈外，導致眼底出血。我們總結(jié)前人論點結(jié)合自己的臨床經(jīng)驗對本病提出了活血利水之法，認為在本病的整個治療過程中不僅要活血通脈，而且要利水散結(jié)明目。正如唐容川在《血證論》所述：“血病而不離乎水”；“血積既久，其水乃成”；“水病而累及血，瘀血化水?！蔽覀冋J為RVO患者在臨床上除有出血表現(xiàn)外，由于血管阻塞，脈中津液和出血一起外滲，往往伴有視網(wǎng)膜的水腫、滲出，不少患者還伴有黃斑囊樣水腫，眼底熒光血管造影時即可見到黃斑區(qū)強熒光。因此，其病變過程中始終存在著水血夾雜的病機，在病變的中后期又表現(xiàn)為水血互結(jié)，因而必須水血同治。因水與血在生理上同源，在病理上互累，因而治療上主張用活血通脈利水明目法以活其血，利其水，散其瘀，組方散血明目片。

現(xiàn)代藥理研究表明，散血明目片組方中大部分藥物具有抑制血小板聚集和黏附、改善血液流變性、降低血管的通透性、改善血管的脆性、擴血管、加速止血、防止血栓形成的作用。前期的臨床表明[5]：活血藥與利水藥配合使用，可加快出血的吸收，從而促進病變的早日恢復?；颊呓?jīng)活血通脈利水明目法后，其血液流變學指標明顯改善。同時活血利水之散血明目片能促進玻璃體積血的吸收，改善眼底的狀況，改善全身的血液流變性，降低血液黏滯性和聚集性，降低血小板的活化功能，減輕血管內(nèi)皮細胞的受損等，從而全面改善患者的血瘀狀況，加速積血的清除，提高玻璃體積血患者的視功能[6-7]；散血明目片能夠明顯降低兔視網(wǎng)膜靜脈阻塞RVO模型ET-1表達，抑制其PAI-1、VEGF、bFGF在視網(wǎng)膜上高表達，誘導tPA的高表達，抑制血栓形成[8-9]。

生物細胞在受熱和其他許多損傷因素、應激刺激(如缺氧、缺血、病毒感染、DNA損傷)等作用后，發(fā)生熱休克反應，抑制一些正常蛋白質(zhì)的合成，同時啟動一類新的蛋白質(zhì)合成基因——熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)基因，合成HSP，HSP對細胞損傷具有保護作用。在HSP大家族中，HSP70是一類最保守和最重要的成員，在幾乎所有生物的應激細胞中都經(jīng)常高度地被誘導，廣泛參與各種保護機體和細胞的功能[10]。Caprioli等研究發(fā)現(xiàn)，HSP70能夠?qū)褂扇毖鸬囊暰W(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞損傷[11]。Sato等認為，在熱休克對神經(jīng)元細胞產(chǎn)生的保護作用中，HSP70起著至關(guān)重要的作用[12]。多項研究表明HSP對視網(wǎng)膜色素上皮具有保護作用，其作用機制可能與增強RPE細胞對氧化應激的耐受性和抑制應激誘導的RPE細胞的凋亡有關(guān)。

視網(wǎng)膜靜脈阻塞(RVO)是眼科常見的一種缺血性視網(wǎng)膜病變，發(fā)病機制至今尚未完全明了。本實驗采用免疫組織化學染色法觀察散血明目片對實驗性視網(wǎng)膜靜脈阻塞兔HSP70表達的影響，從另一個方面探討散血明目片應用于視網(wǎng)膜靜脈阻塞的作用機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)散血明目片組兔視網(wǎng)膜組織中HSP70陽性表達的平均光密度值及其持續(xù)時間均較對照組明顯增大。說明散血明目片能誘導缺血視網(wǎng)膜組織中HSP70的表達，發(fā)揮自身保護作用，從而減小組織損傷。研究表明HSP70對缺血視網(wǎng)膜組織的保護作用可能與其能增強細胞對抗自由基的能力，在應激狀態(tài)下保護抗氧化酶如SOD等的活性[13]，并能維持細胞的正常功能等方面的作用有關(guān)。

[1]彭清華.中西醫(yī)結(jié)合眼科學[M].第1版，北京:中國中醫(yī)藥出版社，2010：569.

[2]彭清華，李建超，張 琳，等.散血明目片治療玻璃體積血的臨床及實驗研究[J].中國醫(yī)藥學報，2004，19(增刊):61-64.

[3]彭清華，喻京生，曾明葵，等.活血通脈、利水明目法治療玻璃體積血的臨床研究[J]. 湖南中醫(yī)學院學報，2003，23（1）：39-42.

[4]周正申，王 玲，王康孫.視網(wǎng)膜靜脈阻塞的動物模型[J].中國實用眼科雜志，2003，21（6）：447-451.

[5]彭清華.活血利水法為主治療視網(wǎng)膜靜脈阻塞的臨床研究[J].中國中醫(yī)眼科雜志,1994,4(4):206-209.

[6]張 琳,彭清華,李建超.散血明目片治療玻璃體積血的實驗研究[J].中國中醫(yī)眼科雜志，2002，12(2):63-66.

[7]李建超,彭清華,趙海濱,等.散血明目片抑制積血所致PVR的實驗研究[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學雜志，2002，8(11):36-39.

[8]彭清華，彭 俊，張波濤，等.復方中藥散血明目片對兔視網(wǎng)膜靜脈阻塞 ET-1 表達的影響.國際眼科雜志，2009，9（11）：2 075-2 077.

[9]彭清華，彭 俊，曾志成，等.散血明目片對兔視網(wǎng)膜靜脈阻塞模型tPA、PAI-1表達的影響 [J].中華中醫(yī)藥雜志，2010，25（8）：1 299-1 302.

[10]曲凌云，孫修勤，相建海，等.熱休克蛋白研究進展[J].海洋科學進展，2004，22（3）：385-386.

[11]Caprioli J，Kitano S，Morgan JE，et a1.Hyperthemia and hypoxia in crease tolerance of retinal ganglion cells to anoxia and excitotoxicit[J].Invest Ophthalmol Vis Sei，1996，37(12)：2 376-2 381.

[12]Sato K，Saito H，Matsuki N.HSP70 is essential to the neuroprotective efect of heat shock[J].Brain Res，1996，740(1-2)：117-123.

[13]Kita T.The role of heat shock proteins on the disorderd tissues：implication for the pathogenesis and diagnosticsin the forensic-practis[J].Nippon Hoigaka Zasshi，2OOO，54(3)：367-371.