ATP對(duì)髓袢升支粗段管周膜50pS鉀通道的調(diào)節(jié)

張成標(biāo)，楊 雷，谷瑞民

(1.徐州醫(yī)學(xué)院麻醉學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇徐州 221002;2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，黑龍江哈爾濱 150086)

腎臟髓袢升支粗段(thick ascending limb of henle’s loop)對(duì)NaCl的主動(dòng)重吸收，啟動(dòng)了髓質(zhì)滲透梯度建立，在尿液的濃縮和稀釋中發(fā)揮重要作用。髓袢升支粗段對(duì)NaCl主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的動(dòng)力來自上皮細(xì)胞管周膜上的鈉－鉀泵，而管周膜上的鉀通道也參與了NaCl的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)過程。由于鉀通道的活性受多種內(nèi)源性活性物質(zhì)或藥物的影響［1－2］，而鈉－鉀泵活動(dòng)必然引起細(xì)胞內(nèi)ATP濃度發(fā)生變化，因此，ATP對(duì)管周膜鉀通道是否有調(diào)節(jié)作用值得探討。髓袢升支粗段管周膜存在多種不同電導(dǎo)的鉀通道，其中50 pS鉀通道數(shù)量最多，提示其可能在NaCl的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)中起重要作用。本實(shí)驗(yàn)利用單通道膜片鉗技術(shù)，觀察ATP對(duì)髓袢升支粗段管周膜50 pS鉀通道活動(dòng)的影響，進(jìn)一步闡明髓袢升支粗段對(duì)NaCl的重吸收機(jī)制，為開發(fā)新的高效、安全利尿藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 腎小管的分離 健康SD(Sprague-Dawley)大鼠，體質(zhì)量70～100 g，♀♂不限。由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第二臨床學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大鼠在頸關(guān)節(jié)脫位后，立即打開腹腔取出腎臟，去除包膜，從腎臟的中間部分用刀片切出厚0.5～1 mm的冠狀切片，浸入濃度為1 g·L－1膠原酶溶液，放進(jìn)37℃恒溫水浴箱中消化45～60 min。在體視顯微鏡下分離出腎小管髓袢升支粗段，放在涂有多聚賴氨酸的載玻片(5 mm×5 mm)上固定并移送至膜片鉗系統(tǒng)的細(xì)胞記錄槽中。

1.2 膜片鉗單通道記錄 用PP-830型微電極拉制儀(Narishige，日本)兩步拉制玻璃微電極，微電極尖端的直徑約為0.5～1.0 μm，拉制完成后再適度拋光。在內(nèi)充電極內(nèi)液時(shí)，電極的入液電阻為20～50 MΩ。

選取清潔、光滑、完整、結(jié)構(gòu)清晰的腎小管進(jìn)行膜片鉗實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)主要采用細(xì)胞貼附式(cell-attached)和內(nèi)面向外式(inside-out)兩種單通道電流記錄方法。對(duì)經(jīng)膠原酶消化過的髓袢升支粗段腎小管的管周膜進(jìn)行封接，形成高阻封接后即形成細(xì)胞貼附式記錄模式。在細(xì)胞貼附式記錄模式下，向上提起玻璃微電極出液面后再入液即形成內(nèi)面向外式記錄模式。

實(shí)驗(yàn)使用的膜片鉗系統(tǒng)Axopatch200B膜片鉗放大器、Digidata 1322模－數(shù)轉(zhuǎn)換器、記錄和分析軟件為pCLAMP 9.2(Axon公司，美國)。采樣頻率為10 kHz，濾波頻率為0.2 kHz。用通道總開放概率NP0作為衡量通道活性大小的指標(biāo)，它是單個(gè)通道開放概率(open probability，P0)與通道開放數(shù)(N)的乘積，其數(shù)值可用公式NP0=Σ(1×t1+2×t2+…+i×ti)計(jì)算。公式中的i表示通道開放的電流水平，在該水平有i個(gè)通道同時(shí)開放;ti表示通道在該水平開放的持續(xù)時(shí)間占總時(shí)間的分?jǐn)?shù)。

1.3 實(shí)驗(yàn)溶液及藥品 電極內(nèi)液(mmol·L－1):KCl 140，MgCl21.8，HEPES 10(pH=7.4)。浴液(mmol·L－1):NaCl 140，KCl 5，CaCl21.8，MgCl21.8，HEPES 10(pH=7.4)。膠原酶(Collagenase type IA，購于Sigma公司)溶液在每次實(shí)驗(yàn)時(shí)臨時(shí)配制，每次稱取1～2 mg，用浴液稀釋成濃度為1g·L－1的酶溶液。ATP(購于Sigma公司)先用浴液配制成一定濃度的母液凍存或置于0～4℃?zhèn)溆?，?shí)驗(yàn)時(shí)用微量加樣器抽取一定量的藥液加入細(xì)胞記錄槽，使浴槽中的藥物濃度達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。

1.4 劑量-效應(yīng)關(guān)系 在形成內(nèi)面向外式記錄模式后，每隔5 min依次向浴槽內(nèi)加入一定量的ATP母液，使浴液中的ATP濃度分別達(dá)到0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol·L－1，觀察不同濃度的 ATP 對(duì)50 pS鉀通道活動(dòng)的影響，并繪制劑量反應(yīng)曲線。

2 結(jié)果

2.1 記錄通道類型及電導(dǎo)大小的確定 實(shí)驗(yàn)中記錄到的單通道電流能被鉀通道阻斷劑Ba2+阻斷(Fig 1)，證明其是鉀通道。該通道的單通道電流大小隨著鉗制電壓的變化而變化，以電壓為橫坐標(biāo)、電流為縱坐標(biāo)可作出電流－電壓(I-U)曲線(Fig 2)，根據(jù)曲線斜率計(jì)算出通道電導(dǎo)約為50 pS。在髓袢升支粗段管周膜記錄到的單通道電流中，50 pS鉀通道電流出現(xiàn)的頻率最大，約占鉀通道電流總數(shù)的75%。

Fig 1 The effect of 1mmol·L-1Ba2+(BaCl2was added to the bath solution)on channel activity in an inside-out patch Holding potential was 0 mV;C:channel-closed level

Fig 2 Current(I)-voltage(U)curve of 50 pS K+channel obtained from a cell-attached patch

2.2 ATP對(duì)髓袢升支粗段50 pS鉀通道活性的影響

2.2.1 在細(xì)胞貼附式(cell-attached)膜片鉗記錄模式下，ATP對(duì)50 pS鉀通道活性的影響 在鉗制電壓為0 mV時(shí)，形成細(xì)胞貼附式封接并記錄50 pS鉀通道電流，記錄3～5 min后向浴槽內(nèi)加入一定量的ATP母液，使浴液中的ATP濃度達(dá)到1.0 mmol·L－1。加藥前后50 pS鉀通道的開放概率分別為0.42±0.21和0.38±0.20，兩者差異無顯著性(n=8，P＞0.05)。Fig 3是一例典型的膜片鉗記錄，顯示在細(xì)胞貼附式膜片鉗模式下，1.0 mmol·L－1ATP對(duì)50 pS鉀通道活性無影響。

2.2.2 在內(nèi)面向外式(inside-out)記錄模式下，ATP對(duì)50 pS鉀通道活性的影響 在細(xì)胞貼附式記錄模式下，提起玻璃微電極出液面后再入液，即可形成內(nèi)面向外式單通道電流記錄模式。先記錄3～5 min，然后向浴槽內(nèi)加入ATP使其濃度達(dá)到1.0 mmol·L－1，結(jié)果該濃度的ATP抑制了50 pS鉀通道的開放，NPo從加藥前的0.46±0.28降低到0.02±0.04(n=8，P＜0.01)，將 ATP洗脫后 NPo恢復(fù)到0.41±0.25。Fig 4是一例典型的內(nèi)面向外式單通道記錄，顯示1.0 mmol·L－1ATP對(duì)50 pS鉀通道具有可逆性抑制效應(yīng)。

劑量反應(yīng)曲線表明，ATP對(duì)50 pS鉀通道的抑制作用與其濃度正相關(guān)(Fig 5)。

Fig 3 Effect of 1 mmol·L-1ATP on the activity of the basolateral 50 pS K+channel in the TAL of rat kidney in cell-attached patches

Fig 4 Effect of 1 mmol·L-1ATP on the activity of the basolateral 50 pS K+channel in the TAL of rat kidney in inside-out patches

Fig 5 The dose-response curve of the ATP effect on the basolateral 50 pS K+channels in inside-out patches

3 討論

腎臟髓袢升支粗段對(duì)Na+和Cl－的主動(dòng)重吸收是髓質(zhì)滲透梯度建立的直接動(dòng)力，在尿液的濃縮和稀釋方面發(fā)揮重要作用。這種作用與髓袢升支粗段的特殊結(jié)構(gòu)有關(guān)，該段腎小管上皮細(xì)胞的管腔膜存在Na+-2Cl－-K+同向轉(zhuǎn)運(yùn)體，而管周膜上有鈉－鉀泵和氯通道，Na+-2Cl－-K+轉(zhuǎn)運(yùn)體將小管液中的Na+、K+和Cl－轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)，鈉－鉀泵和氯通道再將細(xì)胞內(nèi)Na+和Cl－轉(zhuǎn)運(yùn)至組織間液。髓袢升支粗段上皮細(xì)胞的管周膜和管腔膜上均存在鉀通道，這些通道在NaCl的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)過程中也發(fā)揮重要作用，因?yàn)殁浲ǖ缹⑦M(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的K+(通過Na+-2Cl－-K+同向轉(zhuǎn)運(yùn)體和鈉－鉀泵)即時(shí)地轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外，維持了上述轉(zhuǎn)運(yùn)過程的正常進(jìn)行。因此，管周膜上的鈉－鉀泵與鉀通道在功能上是偶聯(lián)的。細(xì)胞內(nèi)ATP含量的變化可能是將二者聯(lián)系起來的關(guān)鍵因素，因?yàn)殁c－鉀泵活動(dòng)會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)ATP濃度發(fā)生變化，而鉀通道家族中存在ATP敏感鉀通道。除了ATP以外，腺苷也可能是將鈉－鉀泵與鉀通道活動(dòng)偶聯(lián)起來的關(guān)鍵物質(zhì)，因?yàn)殁c－鉀泵活動(dòng)的增強(qiáng)或減弱不僅引起細(xì)胞內(nèi)ATP消耗增多或減少，也使經(jīng)ATP分解代謝途徑生成的腺苷發(fā)生相應(yīng)的變化，而腺苷對(duì)髓袢升支粗段管周膜鉀通道有激活作用［5］。但腺苷對(duì)管周膜鉀通道的激活作用只發(fā)生在高濃度(1 μmol以上)的情況下，生理濃度(50～200 nmol·L－1)的腺苷對(duì)髓袢升支粗段管周膜鉀通道并無激活作用［3－4］，提示在生理?xiàng)l件下，腺苷并不參與管周膜鉀通道活動(dòng)的調(diào)控，可能在某些病理生理?xiàng)l件下(如缺血、缺氧等)，組織細(xì)胞釋放大量腺苷時(shí)才影響鉀通道的功能。我們?cè)谒桉壬Т侄喂苤苣つてQ實(shí)驗(yàn)中記錄到最多的是50 pS鉀通道，這與文獻(xiàn)報(bào)道［5－6］一致，提示50 pS鉀通道具有重要功能。本實(shí)驗(yàn)顯示，在內(nèi)面向外式記錄模式下，1 mmol·L－1的ATP幾乎完全阻斷了髓袢升支粗段管周膜50 pS鉀通道的開放，而在細(xì)胞貼附模式下，同樣濃度的ATP對(duì)50 pS鉀通道的活性無明顯影響。劑量反應(yīng)曲線表明，在內(nèi)面向外式記錄模式下，ATP對(duì)髓袢升支粗段管周膜50 pS鉀通道的抑制作用具有劑量依賴性。這些結(jié)果說明，細(xì)胞內(nèi)ATP含量的變化是調(diào)節(jié)50 pS鉀通道活性的重要因素。ATP敏感性鉀通道廣泛存在于肌肉、神經(jīng)、腺垂體等可興奮性組織以及腎小管上皮、卵泡的卵母細(xì)胞等非興奮性組織［7－8］，受細(xì)胞內(nèi) ATP 濃度的調(diào)控，因此，髓袢升支粗段管周膜50 pS鉀通道可能是一種ATP敏感性鉀通道。在基礎(chǔ)條件下，細(xì)胞內(nèi)ATP的濃度約為3～5 mmol·L－1，但在進(jìn)行某些耗能活動(dòng)時(shí)(如物質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn))，細(xì)胞內(nèi)的 ATP濃度可降至1 mmol·L－1以下［9］，在內(nèi)面向外式記錄模式下，1 mmol·L－1的ATP幾乎完全抑制50 pS鉀通道的開放，表明在基礎(chǔ)條件下，髓袢升支粗段管周膜50 pS鉀通道可能受到高濃度ATP的抑制而處于關(guān)閉狀態(tài)，但當(dāng)NaCl的主動(dòng)重吸收明顯增強(qiáng)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)ATP濃度降低，對(duì)50 pS鉀通道的抑制作用減弱，鉀通道開放概率逐漸增加，從而將因鈉－鉀泵活動(dòng)增強(qiáng)而涌入細(xì)胞內(nèi)的K+及時(shí)地轉(zhuǎn)移至細(xì)胞外(組織間液)，維持細(xì)胞內(nèi)外正常的K+濃度梯度和正常的膜電位水平，使髓袢升支粗段對(duì)NaCl的主動(dòng)重吸收能持續(xù)地進(jìn)行。因此，髓袢升支粗段管周膜50 pS鉀通道受細(xì)胞內(nèi)ATP調(diào)控，這種調(diào)控作用的意義可能是把鉀通道和鈉－鉀泵在功能上聯(lián)系起來。

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