大孔吸附樹脂分離純化追風(fēng)傘總黃酮的研究

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(貴州大學(xué)生化營養(yǎng)研究所，貴州 貴陽 550025)

追風(fēng)傘(LysimachiaparidiformisFranch.var.Stenophylla Franch.)系報(bào)春花科植物狹葉落地梅的全草或根，主要分布于湖南、四川、貴州等地。追風(fēng)傘多以全草入藥，有祛風(fēng)通絡(luò)、活血止痛等功效，具有較高的藥用價(jià)值[1,2]，其中黃酮類成分含量豐富[3]。

大孔吸附樹脂是一種人工合成的具有多孔立體結(jié)構(gòu)的聚合物吸附劑，性能優(yōu)良，已在醫(yī)藥領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，尤其是可用于純化中藥的有效成分[4，5]。研究表明，大孔吸附樹脂用于黃酮類化合物的提取分離、精制純化效果較好[6～8]，但目前尚未見將其用于追風(fēng)傘中總黃酮的分離純化。作者在此采用大孔吸附樹脂對追風(fēng)傘總黃酮進(jìn)行分離純化，優(yōu)化了工藝條件，擬為追風(fēng)傘資源的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

追風(fēng)傘全草購于貴州省貴陽市花果園藥材市場。

蘆丁對照品(批號0080-9705)，中國藥品生物制品檢定所；D101、H103、D4020、NKA-9、S-8、X-5、AB-8型大孔吸附樹脂，天津南開大學(xué)化工廠；其它試劑均為分析純。

TU-1901型紫外分光光度儀，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；1004型電子分析天平，上海天平儀器廠；98-1-B型電子調(diào)溫電熱套，天津市泰斯特儀器有限公司；GZX-9140MBE型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海博達(dá)實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2 樣品制備及測定方法

1.2.1 供試品溶液的制備

取追風(fēng)傘干品粗粉100 g，依次加入12 BV、10 BV、8 BV的50%乙醇，加熱回流提取，每次3 h，合并提取液，濾過。濾液減壓回收乙醇至無醇味。濃縮液加水稀釋，靜置，抽濾除去不溶性物質(zhì)，濾液再次濃縮，即得追風(fēng)傘供試品溶液，冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取干燥至恒重的蘆丁對照品23.50 mg，置100 mL容量瓶中，加入適量60%乙醇溶液超聲溶解，稀釋至刻度，搖勻，得標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密量取標(biāo)準(zhǔn)溶液0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL，分別置于25 mL容量瓶中，各加60%乙醇至6 mL；各加5% NaNO2溶液1 mL，搖勻，放置6 min；各加10% Al(NO3)3溶液1 mL，搖勻，放置6 min；各加4% NaOH溶液10 mL；最后各加60%乙醇至刻度，搖勻，靜置15 min，用紫外分光光度儀在500 nm波長處測定吸光度。以吸光度值(A)對濃度(c)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合線性回歸方程為：A=0.01076c+0.0019，R=0.9999，線性范圍為0～56.4 μg·mL-1。

1.2.3 樣品的測定

取一定量待測供試品溶液于25 mL容量瓶中，按1.2.2方法測定吸光度，計(jì)算供試液中總黃酮的含量。

1.3 大孔吸附樹脂對追風(fēng)傘總黃酮的靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

1.3.1 大孔吸附樹脂預(yù)處理

用95%乙醇浸泡樹脂24 h，使其充分溶脹，除去上浮樹脂碎片和雜物，濕法裝柱，用95%乙醇以適當(dāng)流速通過樹脂柱，洗至流出液與蒸餾水(1∶5)混合無白色混濁現(xiàn)象，然后用大量蒸餾水洗至無醇味，備用。

1.3.2 大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附量測定

精確稱取1.0 g預(yù)處理好的大孔吸附樹脂于具塞磨口錐形瓶中，加入總黃酮濃度為1.860 mg·mL-1的追風(fēng)傘供試液50 mL，于室溫下150 r·min-1振蕩24 h，充分吸附后，過濾并測定濾液中總黃酮濃度，按式(1)、式(2)分別計(jì)算各樹脂的靜態(tài)吸附量(Q，mg·g-1)和吸附率(E)。

(1)

(2)

式中：c0為初始濃度，mg·mL-1；ce為平衡濃度,mg·mL-1；V1為原溶液體積，mL；m為樹脂質(zhì)量，g。

1.3.3 大孔吸附樹脂的解吸率測定

將吸附飽和的樹脂濾出，吸干表面水分，加入80%(體積分?jǐn)?shù))乙醇溶液50 mL，于室溫下150 r·min-1振蕩24 h，充分解析后，過濾并測定濾液中總黃酮濃度，按式(3)、式(4)分別計(jì)算解吸率(D)與回收率(P)。

(3)

(4)

式中:cx為解吸溶液濃度,mg·mL-1；V2為解吸溶液體積，mL。

1.4 大孔吸附樹脂對追風(fēng)傘總黃酮的動態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

1.4.1 動態(tài)吸附曲線的繪制以及動態(tài)飽和吸附量的測定

將一定濃度的追風(fēng)傘供試液通過裝有10.0 g已預(yù)處理大孔吸附樹脂的層析柱，分段收集流出液，每10 mL收集1份，共收集36份，測定每段收集液中總黃酮的濃度，當(dāng)流出液中總黃酮濃度(c)與初始樣品液中總黃酮濃度(c0)基本趨于一致時(shí)停止上樣，以c/c0對收集時(shí)間(t)繪制動態(tài)吸附曲線。

用少量蒸餾水沖洗層析柱，使樹脂床中的上樣液完全流出，合并流出液，測定流出液體積以及總黃酮的濃度。然后靜置20 min，再用大量蒸餾水沖洗樹脂，直至流出的水洗液接近無色，收集水洗液，測定水洗液體積和總黃酮的濃度。計(jì)算樹脂動態(tài)飽和吸附量。

動態(tài)飽和吸附量=(上樣液中總黃酮濃度×上樣液體積-流出液中總黃酮濃度×流出液體積-水洗液中總黃酮濃度×水洗液體積)/濕樹脂質(zhì)量

1.4.2 動態(tài)吸附和動態(tài)解吸實(shí)驗(yàn)

稱取10.0 g已預(yù)處理的樹脂，濕法裝柱。將一定濃度的追風(fēng)傘供試液通過樹脂柱，測定流出液中總黃酮的濃度，以總黃酮吸附量、回收率為指標(biāo)考察上樣液的濃度及流速等因素對樹脂吸附性能的影響；將一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇通過裝有已吸附樣品的樹脂柱，測定不同洗脫條件下洗脫液中總黃酮的濃度，以總黃酮回收率、解吸率為指標(biāo)考察洗脫劑體積分?jǐn)?shù)及其用量等因素對樹脂解吸性能的影響，從而篩選出樹脂動態(tài)吸附和解吸的最佳工藝參數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附與解吸結(jié)果

選擇7種不同表面性質(zhì)(樹脂的極性和空間結(jié)構(gòu))的樹脂對樣品溶液進(jìn)行吸附處理，測其靜態(tài)吸附量和解吸率，結(jié)果見表1。

表1 不同大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附量和解吸率

由表1可知， 7種樹脂對追風(fēng)傘總黃酮的吸附容量以及解吸性能存在差異。其中，S-8型樹脂易吸附，但解吸率太低，不適用于分離；D101型樹脂有較大的靜態(tài)吸附量，同時(shí)也較容易解吸附，表現(xiàn)出較好的綜合吸附純化能力。綜合分析，選擇D101型大孔吸附樹脂進(jìn)行動態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)。

2.2 D101型大孔吸附樹脂的動態(tài)吸附結(jié)果

2.2.1 動態(tài)吸附曲線(圖1)

圖1 D101型大孔吸附樹脂對總黃酮的動態(tài)吸附曲線

由圖1可見，當(dāng)吸附時(shí)間達(dá)到150 min(即收集液體積達(dá)到300 mL)左右時(shí)，D101型大孔吸附樹脂對追風(fēng)傘總黃酮的吸附已經(jīng)基本趨向飽和。

2.2.2 動態(tài)飽和吸附量

實(shí)驗(yàn)中，上樣液濃度為3.286 mg·g-1時(shí)，流出液和水洗液中的總黃酮量為186 mg，D101型大孔吸附樹脂的動態(tài)飽和吸附量為80.05 mg·g-1，與其靜態(tài)吸附量存在一定的差異，有待進(jìn)一步研究。

2.2.3 上樣液濃度的確定

取已預(yù)處理的D101型大孔吸附樹脂10.0 g，濕法裝柱，將不同濃度的追風(fēng)傘提取液，以不同體積、相同流速上樣。測定吸附后溶液中總黃酮濃度，計(jì)算吸附量。適量水洗后，用70%乙醇洗脫完全，分別收集洗脫液測定總黃酮濃度，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。

表2 上樣液濃度對總黃酮吸附量和回收率的影響

由表2可知，當(dāng)上樣液總黃酮濃度為1.839 mg·mL-1時(shí)，D101型大孔吸附樹脂對追風(fēng)傘總黃酮吸附量最大，回收率也最高。因此，選擇適宜的上樣液總黃酮濃度為1.839 mg·mL-1。

2.2.4 上樣流速的確定

將追風(fēng)傘提取液通過D101型大孔吸附樹脂柱，以相同體積、不同流速進(jìn)行動態(tài)吸附，測定吸附后溶液中總黃酮濃度，計(jì)算吸附量。適量水洗后，用70%乙醇洗脫完全，收集洗脫液測定吸光度，考察不同上樣流速下樹脂的吸附效果和產(chǎn)品的回收率，結(jié)果見表3。

表3 上樣流速對總黃酮吸附量和回收率的影響

由表3可知，上樣流速越大，樹脂泄漏越早，其吸附量相應(yīng)下降。原因可能是在吸附動態(tài)平衡過程中，相同的吸附速度下加快流速，則吸附時(shí)間相對縮短，從而影響了樹脂的吸附效果；而放緩上樣流速，固然可提高其吸附量，但卻延長了達(dá)到飽和吸附所需時(shí)間，也會影響工作效率。綜合考慮，選擇上樣流速為2.0 mL·min-1左右較為合適。

2.2.5 洗脫劑體積分?jǐn)?shù)的確定

將追風(fēng)傘提取液通過D101型大孔吸附樹脂柱，以相同流速進(jìn)行動態(tài)吸附，然后用水洗脫至洗脫液近無色，再分別用30%、50%、70%、90%乙醇洗脫，回收乙醇，蒸干，定容于100 mL容量瓶后測定吸光度，計(jì)算解吸率、回收率以及總黃酮純度，結(jié)果見表4。

表4 洗脫劑體積分?jǐn)?shù)對總黃酮解吸率、回收率及純度的影響

由表4可知，90%乙醇洗脫產(chǎn)物的解吸率與回收率最高，70%乙醇次之；但是70%乙醇洗脫產(chǎn)物總黃酮純度最高，且回收率、解吸率與90%乙醇相近。從節(jié)約成本角度考慮，選擇70%乙醇液為洗脫劑。

2.2.6 洗脫曲線

按上述確定的吸附和洗脫條件，取追風(fēng)傘供試品溶液上柱，然后洗脫，分段收集洗脫液。每10 mL收集1份，共收集20份，分別檢測洗脫液中追風(fēng)傘總黃酮濃度，繪制動態(tài)洗脫曲線，結(jié)果見圖2。

圖2 D101型大孔吸附樹脂對總黃酮的動態(tài)洗脫曲線

由圖2可見，當(dāng)洗脫液體積為180～200 mL時(shí)，總黃酮濃度相當(dāng)，即洗脫液體積為180 mL時(shí)，總黃酮已接近洗脫完全。洗脫劑用量過多會增加洗脫時(shí)間，延長生產(chǎn)周期，同時(shí)也造成浪費(fèi)，故確定洗脫劑用量以6 BV(以樹脂柱體積計(jì))為宜。

2.2.7 動態(tài)吸附洗脫驗(yàn)證

取適量追風(fēng)傘供試液在優(yōu)選的工藝條件下分離純化追風(fēng)傘總黃酮。收集所需成分，測定其濃度后干燥，稱重，得棕黃色粉末。然后精密稱取100 mg精提物粉末(過大孔吸附樹脂純化后的總黃酮粉末)和粗提物粉末(直接濃縮提取液干燥得到)各1份， 分別用60%乙醇使其溶解后定容于100 mL容量瓶中，搖勻，平行取3份測定總黃酮濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)大孔吸附樹脂純化得到的精提物中追風(fēng)傘總黃酮的純度可達(dá)86.2%，約為粗提物純度(20.65%)的4倍，且回收率超過90%。

3 結(jié)論

通過靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)比較了7種不同類型大孔吸附樹脂的吸附特性，綜合考察吸附能力與解吸性能，篩選出D101型大孔吸附樹脂用于追風(fēng)傘總黃酮的純化富集。通過動態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)，確定D101型大孔吸附樹脂吸附純化追風(fēng)傘總黃酮的最佳工藝為：上樣液總黃酮濃度為1.839 mg·mL-1，上樣流速為2.0 mL·min-1；洗脫劑為70%乙醇，洗脫劑用量為6 BV。D101型大孔吸附樹脂吸附追風(fēng)傘總黃酮的動態(tài)飽和吸附量為80.05 mg·g-1，純化的追風(fēng)傘總黃酮純度達(dá)到86.2%，約為純化前的4倍，且回收率超過90%。D101型大孔吸附樹脂適于追風(fēng)傘總黃酮的吸附純化。

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