N,N-二羧甲基殼聚糖的制備及其鹽的抑菌作用研究

甲殼素廣泛存在于海洋生物蟹、蝦的殼中和真菌的細胞壁中，其脫乙?；a(chǎn)物殼聚糖是一種氨基多糖，具有良好的生物相容性和可降解性。殼聚糖分子結構中有大量氨基(或酰胺基)和羥基，能夠選擇性地螯合一些金屬離子，但是殼聚糖不溶于水，限制了它的應用。為了改變其溶解性能，擴大應用范圍，許多學者致力于其化學結構修飾研究[1～3]，得到不同取代度、不同取代位置的羧甲基殼聚糖，羧甲基殼聚糖對Cu2+、Zn2+、Ag+等金屬離子有較強的絡合能力[4～6]。作者以單氯乙酸為改性劑對殼聚糖進行化學修飾，制備了N,N-二羧甲基殼聚糖 (N,N-Dicarboxymethylchitosan,DCMC)[7]及其鋅鹽(DCMC-Zn)、銀鹽(DCMC-Ag)、銅鹽(DCMC-Cu)，并考察了其對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌作用。

1 實驗

1.1 原料、試劑和儀器

殼聚糖(脫乙酰度≥94%,80目)，濟南海得貝海洋生物工程有限公司；氯乙酸、碳酸鈉、無水乙醇、氯化鈉、硝酸銀、硝酸鋅、硫酸銅,均為分析純。

肉湯培養(yǎng)基：NaCl 0.025 g,蛋白胨0.50 g,牛肉膏0.15 g，蒸餾水50 mL。

大腸埃希氏菌、金黃色葡葡球菌均為青島科技大學藥學研究室提供。

DF-101S型集熱式恒溫磁力攪拌器，河南予華儀器有限責任公司；PHS-25型數(shù)顯酸度計，上海雷磁；FTIR8400型紅外光譜儀,日本島津；紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；SW-CJ-1F型單人雙面凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司；RXZ智能型人工氣候箱，寧波江南儀器廠。

1.2 方法

1.2.1N,N-二羧甲基殼聚糖的合成

取1 g殼聚糖溶脹于100 mL水中，膨化24 h，慢慢加入4 g單氯乙酸，劇烈攪拌至殼聚糖全部溶解，混合均勻；在劇烈攪拌下逐滴加入10%的Na2CO3溶液，調(diào)節(jié)pH值至8.0，得到均勻溶液；在90℃下反應3 h，冷卻后過濾，濾出不溶物。濾液用1% HCl調(diào)pH值，析出沉淀，靜置，去除上清液，沉淀先用90%乙醇水溶液洗滌，再用無水乙醇多次洗滌，60℃下干燥，粉碎，得到淡黃色粉末，即N,N-二羧甲基殼聚糖。

1.2.2N,N-二羧甲基殼聚糖鋅、銀、銅鹽的制備

1.2.2.1N,N-二羧甲基殼聚糖鋅鹽的制備

在N,N-二羧甲基殼聚糖(0.40 g)的水溶液中加入0.06 g Zn(NO3)2,在pH值6.5、60℃條件下絡合反應30 min，得到白色粉末絡合物，產(chǎn)物不溶于水和乙醇，也不溶于堿性溶液，可溶于稀酸。

1.2.2.2N,N-二羧甲基殼聚糖銀鹽的制備

磁力攪拌下，在N,N-二羧甲基殼聚糖(0.40 g)水溶液中加入0.50 g AgNO3反應1 h，反應液用丙酮結晶抽濾后，先以無水乙醇反復洗滌，直至無Ag+檢出，再用甲醇多次洗滌，于60℃真空干燥，得到褐色絡合物。

1.2.2.3N,N-二羧甲基殼聚糖銅鹽的制備[5]

稱取0.40 gN,N-二羧甲基殼聚糖溶于50 mL水中，攪拌均勻，另加入0.40 g CuSO4·5H2O于5 mL蒸餾水中溶解完全，攪拌下將硫酸銅溶液逐滴加入到均一的羧甲基殼聚糖溶液中，在30℃、pH值6.5下反應2 h，得到藍色絡合物。

1.2.3 羧甲基殼聚糖及其鋅、銀、銅鹽的抑菌作用考察

將殼聚糖、苯甲酸鈉、N,N-二羧甲基殼聚糖及其鋅、銀、銅鹽加入到已配制好的肉湯培養(yǎng)基中，使加入物的濃度分別為100×10-6、200×10-6、400×10-6、600×10-6、800×10-6，然后按照麥氏比濁管使用說明加入3 mL細菌近似濃度為300×106個·mL-1的菌懸液培養(yǎng)，24 h后在600 nm下測定吸光度以判斷微生物的生長狀況，以苯甲酸鈉作為對照，評價N,N-二羧甲基殼聚糖及其鋅、銀、銅鹽的抑菌作用。

1.2.4N,N-二羧甲基殼聚糖等電點的測定[8]

取9份1.2.1取代反應后的濾液20 mL，用10%HCl溶液分別調(diào)節(jié)其pH值至4.0、3.5、3.0、2.7、2.5、2.3、2.0、1.7、1.5，在231 nm處測定各溶液的透光率(T)。由于越接近等電點，N,N-二羧甲基殼聚糖的溶解性越差，導致其水溶液的透光率越小。因此，根據(jù)透光率-pH值曲線，確定產(chǎn)品的等電點。

1.2.5N,N-二羧甲基殼聚糖取代度的測定

精確稱取0.25 g干燥至恒重的N,N-二羧甲基殼聚糖于100 mL燒杯中,用25 mL 0.1 mol·L-1鹽酸標準溶液將其完全溶解后,用0.1 mol·L-1氫氧化鈉標準溶液滴定。同時用酸度計檢測溶液pH值的變化。利用二階導數(shù)法確定拐點處的堿用量。N,N-二羧甲基殼聚糖取代度(DS)依下式[9]計算：

DS=0.161A/(1-0.058A)

A=(V2-V1)c/m

式中:A為每克樣品中羧甲基的物質的量,mmol;V1為滴定過量鹽酸的終點體積,mL;V2為滴定至RNH+(CH2COO-)2所消耗的氫氧化鈉標準溶液的體積,mL;m為樣品凈重,g；c為氫氧化鈉標準溶液濃度，mol·L-1。

2 結果與討論

2.1 紅外光譜分析(圖1、圖2)

圖1 殼聚糖(a)和N,N-二羧甲基殼聚糖(b)的紅外光譜圖

由圖1可知，殼聚糖紅外圖譜中3437 cm-1處是N-H、O-H鍵的伸縮振動吸收峰;2915 cm-1處為CH2上C-H伸縮振動吸收峰，另外2915 cm-1處的峰變寬可能是由于O-H和N-H基團形成了氫鍵，兩振動峰重疊所造成;1597 cm-1附近只有一個明顯的強吸收峰，歸屬于氨基的伸縮振動[10],此處N-H的彎曲振動峰證明了—NH2的存在;與脫乙酰度低的殼聚糖比較,1654 cm-1附近的二級酰胺中C=O伸縮振動吸收峰減少，說明此全脫化殼聚糖的脫乙酰度高。

和殼聚糖相比，N,N-二羧甲基殼聚糖在1597 cm-1附近N-H彎曲振動吸收峰減少，另外在3402 cm-1處存在較平的寬峰，尖峰的減少也說明N-H吸收峰減少，說明此處發(fā)生了N取代反應；1735 cm-1處為-COOH中C=O的特征吸收峰；1637 cm-1處為-COONa中C=O特征吸收峰、羧酸基團的C=O伸縮振動的特征吸收峰；1399 cm-1處為羧酸根上C-O伸縮振動吸收峰；1240 cm-1處為N,N-二羧甲基殼聚糖中C-O-C的伸縮振動吸收峰(殼聚糖環(huán)中O)；1068 cm-1處為C6位上羥基吸收峰和C-O伸縮振動吸收峰。

圖2 N,N-二羧甲基殼聚糖銀鹽(c)、銅鹽(d)、鋅鹽(e)的紅外光譜圖

由圖2可知，絡合反應前后，N,N-二羧甲基殼聚糖與DCMC-Zn、DCMC-Ag、DCMC-Cu的紅外譜圖最大的區(qū)別是N,N-二羧甲基殼聚糖1735 cm-1處吸收峰的消失，1637 cm-1處吸收峰DCMC-Zn、DCMC-Ag、DCMC-Cu分別移到了1609 cm-1、1587 cm-1、1635 cm-1,其余峰型無明顯變化，這說明N,N-二羧甲基殼聚糖與Ag+、Cu2+、Zn2+的絡合反應主要發(fā)生在COO-上。

2.2 N,N-二羧甲基殼聚糖的等電點

在231 nm波長下測定不同pH值下N,N-二羧甲基殼聚糖溶液的透光率，透光率隨pH值變化的曲線見圖3。

圖3 不同pH值N,N-二羧甲基殼聚糖溶液的透光率曲線圖

透光率最低時所對應的pH值即為等電點。由圖3可知，N,N-二羧甲基殼聚糖的等電點為2.5。

2.3 N,N-二羧甲基殼聚糖的取代度

羧甲基殼聚糖的取代度一般以平均每個氨基葡萄糖(Glucosamine,GU)或N-乙酰氨基葡萄糖(N-Acetylglucosamine,AGU)單元上被羧甲基化的基團數(shù)目來表示。通常情況下，羧甲基殼聚糖的取代度均小于2。取代度的大小直接決定了羧甲基殼聚糖的溶解性，取代度大于0.6的CM-CTS易溶于水[3]，隨著取代度的提高，其溶解性相應加強，溶液的透明度也愈好。

圖4為N,N-二羧甲基殼聚糖的電位滴定曲線圖，其中pH=1.6所對應的橫坐標V1為過量HCl的滴定終點，pH=2.5為N,N-二羧甲基殼聚糖的等電點，這與用分光光度法所確定的等電點一致。pH=4.7所對應的橫坐標V2為RNH+(CH2COO-)2的滴定終點。其中V1=9.0 mL、V2=27.0 mL，按照1.2.5方法測得N,N-二羧甲基殼聚糖的取代度為1.99。

圖4 N,N-二羧甲基殼聚糖的滴定曲線

2.4 N,N-二羧甲基殼聚糖及其鹽的抑菌作用

測定了殼聚糖、N,N-二羧甲基殼聚糖及其鋅、銀、銅鹽對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌作用，以苯甲酸鈉作對照，結果見圖5、圖6。

圖5 殼聚糖、苯甲酸鈉、N,N-二羧甲基殼聚糖及其鋅、銀、銅鹽對大腸桿菌的抑菌作用

由圖5可知，殼聚糖、苯甲酸鈉、DCMC-Cu、DCMC-Ag、DCMC-Zn、DCMC對大腸桿菌的抑制作用隨著濃度的增大而增強，其抑菌作用強弱依次為:DCMC-Ag>苯甲酸鈉>殼聚糖>DCMC-Zn>DCMC>DCMC-Cu；DCMC-Ag在濃度為100×10-6時的抑菌作用已經(jīng)明顯強于其它三者，這可能與Ag+本身有較強抑菌作用有關；殼聚糖對大腸桿菌的抑菌作用又強于N，N-二羧甲基殼聚糖及其鋅、銅鹽的抑菌作用,這與殼聚糖本身含有氨基、對大腸桿菌具有較強的抑菌作用有關；DCMC-Cu隨著濃度增大吸光度增加，表示其抑菌作用減弱，這可能與Cu2+濃度增大時顏色加深而影響吸光度的測定有關。

圖6 殼聚糖、苯甲酸鈉、N,N-二羧甲基殼聚糖及其鋅、銀、銅鹽對金黃色葡萄球菌的抑菌作用

由圖6可知,DCMC-Ag、DCMC-Cu、DCMC-Zn、DCMC、殼聚糖及苯甲酸鈉對金黃色葡萄球菌的抑制作用隨著濃度的增大而增強，其抑菌作用強弱依次為:DCMC-Ag>DCMC-Cu>苯甲酸鈉>殼聚糖>DCMC>DCMC-Zn；DCMC-Ag對金黃色葡萄球菌抑制作用最強，其次是DCMC-Cu，DCMC-Zn最弱。DCMC-Ag在100×10-6時已表現(xiàn)出很強的抑菌效果，DCMC-Cu抑菌效果僅次于DCMC-Ag，但明顯強于DCMC-Zn及DCMC。濃度為200×10-6時DCMC-Zn的抑菌作用強于DCMC，當濃度超過300×10-6左右后DCMC-Zn的抑菌效果最弱。

3 結論

與殼聚糖相比，N,N-二羧甲基殼聚糖的水溶性增強，等電點為2.5，取代度為1.99，對Zn2+、Ag+、Cu2+都有很好的絡合作用。高取代度的DCMC對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的抑菌作用不如殼聚糖；DCMC-Ag對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌均有抑菌作用，且抑菌作用最強；DCMC-Cu對革蘭氏陰性菌大腸桿菌的抑制效果不明顯，但對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌卻有著明顯的抑制作用；DCMC-Zn對革蘭氏陰性菌大腸桿菌有抑制作用，而對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌的抑制效果不明顯。

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