幾丁質(zhì)酶高產(chǎn)菌的篩選及其產(chǎn)酶條件的優(yōu)化研究

幾丁質(zhì)(Chitin)又名甲殼素，廣泛存在于蝦、蟹等甲殼動(dòng)物的外殼中，是蝦、蟹等甲殼動(dòng)物可食用部分外的主要廢棄物，自然界每年的產(chǎn)量估計(jì)約100億t，是我國(guó)近海海域主要的有機(jī)污染源之一，同時(shí)又是一種用之不竭的生物資源。幾丁質(zhì)被譽(yù)為人體所必需的第六生命要素，其衍生物低分子量幾丁寡糖因具有多種生物活性，可用于治療艾滋病、癌癥及心血管疾病，在口腔醫(yī)學(xué)和人體保健等領(lǐng)域也有著廣泛的應(yīng)用[1，2]。幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌是一類能利用幾丁質(zhì)作為碳源而生存、繁殖的特殊的微生物群體，它能通過(guò)分泌幾丁質(zhì)酶降解幾丁質(zhì)為幾丁寡糖、幾丁二糖直至幾丁單糖，直接被人體吸收利用，從而使幾丁質(zhì)用途更加廣泛。茂名是一個(gè)海濱城市，蝦、蟹資源非常豐富，蝦、蟹殼等廢棄物一直影響著茂名地區(qū)的生態(tài)環(huán)境。作者在此篩選了一株幾丁質(zhì)酶活力高的菌株并對(duì)其產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，擬為 “漁業(yè)垃圾”蝦、蟹等甲殼動(dòng)物的外殼的再生利用提供理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 土樣及試劑

5份土樣采自茂名沿海地區(qū)。

幾丁質(zhì)粉，上海市生物制品有限公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 培養(yǎng)基

平板分離培養(yǎng)基(g·L-1):膠體幾丁質(zhì)5，K2HPO40.7，KH2PO40.3，MgSO4·7H2O 0.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，瓊脂 15，pH值7.0，蒸餾水定容至1 L。

LB培養(yǎng)基(種子培養(yǎng)基，g·L-1):蛋白胨10，酵母膏 5，氯化鈉10，pH值7.0，蒸餾水定容至1 L。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基(g·L-1)：細(xì)粉幾丁質(zhì)5，蛋白胨10， K2HPO40.7，KH2PO40.3，MgSO4·7H2O 0.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01， pH值7.0，蒸餾水定容至1 L。

1.3 膠體幾丁質(zhì)的制備

稱取10 g幾丁質(zhì)粉末，加入40 mL丙酮，充分研磨至糊狀。在低溫下邊研磨邊慢慢加入濃鹽酸400 mL，幾分鐘后，用玻璃棉過(guò)濾，在劇烈攪拌下將濾液緩緩加入到劇烈攪拌的50%乙醇(至少是濾液的5 BV以上)中，使膠體幾丁質(zhì)沉淀析出，離心收集膠體幾丁質(zhì)，用蒸餾水沖洗幾次，置透析袋過(guò)夜,避光保存在冰箱中。

1.4 菌種篩選方法

采用平板稀釋法。取土樣1 g，用無(wú)菌水以10倍梯度稀釋成10-1～ 10-6稀釋液，取10-4～10-6稀釋液0.1 mL涂幾丁質(zhì)平板，在30℃下培養(yǎng)3～5 d。挑取產(chǎn)透明圈直徑與菌落直徑比最大的菌株純化培養(yǎng)并保存待用。

按照常規(guī)細(xì)菌學(xué)方法[3]鑒定到屬。

1.5 產(chǎn)酶條件實(shí)驗(yàn)方法

取30 mL種子培養(yǎng)基置于 250 mL三角瓶中，接入1～2環(huán)斜面菌種，30℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)2 d作為種子。以2%接種量接入各個(gè)實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)基中，除另有說(shuō)明外，產(chǎn)酶實(shí)驗(yàn)條件均為30℃、180 r·min-1培養(yǎng)72 h，每一實(shí)驗(yàn)3次平行。發(fā)酵培養(yǎng)液經(jīng)過(guò)4層紗布過(guò)濾，再于6000 r·min-1離心10 min，除去沉淀,得粗酶液，測(cè)定酶活力。

采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化產(chǎn)酶條件，正交實(shí)驗(yàn)的因素與水平見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)的因素和水平

1.6 酶活力測(cè)定方法

酶活力測(cè)定用DNS法[4,5]。取1 mL發(fā)酵上清液加入1 mL含1%膠體幾丁質(zhì)的磷酸緩沖溶液(pH值7.0)，50℃保溫 1 h，加入1 mL 3，5-二硝基水楊酸試劑中止反應(yīng)，沸水浴5 min，冰浴冷卻，離心后取上清

液通過(guò)紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)200～700 nm范圍內(nèi)全波掃描，得到最大吸收波長(zhǎng)為470 nm。以不含膠體幾丁質(zhì)的上清液為對(duì)照，測(cè)吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算產(chǎn)生的N-乙酰氨基葡萄糖 (NAG)的量。

酶活單位定義：在特定條件下，每分鐘水解幾丁質(zhì)產(chǎn)生相當(dāng)于1 μmolN-乙酰氨基葡萄糖的還原糖所需的酶量。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株的篩選與初步鑒定

實(shí)驗(yàn)分離得到4株產(chǎn)透明圈較大的菌株，選取產(chǎn)生透明圈最大(透明圈與菌落直徑比2.16)、最穩(wěn)定的一株命名為X，其菌落圓形，淡黃色，不透明，中央凸起，邊緣整齊(圖1a)。在顯微鏡下觀察，該菌為短桿狀，長(zhǎng)0.7～1.0 μm，無(wú)鞭毛(圖1b)，該菌的芽孢形態(tài)為圓形或卵圓形(圖1c)。

圖1 菌株X的菌落形態(tài)和透明圈(a)、顯微鏡下的形態(tài)(b)、芽孢在顯微鏡下的形態(tài)(c)

菌株X的生理生化特征見表2。

表2 菌株X 的生理生化特征

綜合圖1、表1結(jié)果可知，菌體直桿狀，革蘭氏陽(yáng)性，長(zhǎng)0.7～1.0 μm，無(wú)鞭毛不可運(yùn)動(dòng)，好氧型，菌落形態(tài)為圓形，淡黃色，不透明，菌落邊緣整齊，中間隆起，接觸性酶反應(yīng)陰性，V-P和甲基紅試驗(yàn)呈陰性，有芽孢及營(yíng)養(yǎng)體。糖酵解反應(yīng)中產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，符合短芽孢桿菌屬(Brevibacillusshida,Agri,1996)[3]的一般特征。

2.2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株X產(chǎn)酶的影響

以2%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)至24 h開始，每隔12 h取樣品測(cè)酶活，結(jié)果見圖2。

圖2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株X產(chǎn)酶的影響

由圖2可知，菌株X產(chǎn)酶活性在培養(yǎng)72 h 時(shí)達(dá)到最大值，此后隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活迅速下降。后續(xù)實(shí)驗(yàn)均培養(yǎng)至72 h測(cè)定酶活。

2.3 溫度對(duì)菌株X產(chǎn)酶的影響

以2%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，分別在25℃、30℃、35℃、40℃下培養(yǎng)72 h，測(cè)酶活，結(jié)果見圖3。

圖3 溫度對(duì)菌株X產(chǎn)酶的影響

由圖3可知，菌株X在30～35℃溫度范圍內(nèi)產(chǎn)酶活性較高，且較穩(wěn)定。最適產(chǎn)酶溫度在30℃，酶活達(dá)1.02 U·mL-1，在40℃時(shí)菌株產(chǎn)酶活性最低。表明菌株X較適宜在低溫環(huán)境中產(chǎn)酶，過(guò)高的溫度會(huì)抑制其產(chǎn)酶活性。

2.4 初始pH值對(duì)菌株X產(chǎn)酶的影響

以2%接種量接種于初始pH值分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)72 h，測(cè)酶活,結(jié)果見圖4。

圖4 初始pH值對(duì)菌株X產(chǎn)酶的影響

由圖4可知，菌株X在初始pH值為7.0時(shí)產(chǎn)酶活性達(dá)到最大，酶活達(dá)1.08 U·mL-1，其次是pH值為8.0，表明菌株比較適合在弱堿性環(huán)境中產(chǎn)酶，這與許多文獻(xiàn)報(bào)道相一致[6，7]。pH值為4.0時(shí)產(chǎn)酶活性最低，可能是因?yàn)閜H值過(guò)低會(huì)抑制菌株的產(chǎn)酶活性。

2.5 氮源對(duì)菌株X產(chǎn)酶的影響

以2%接種量接種于以細(xì)粉幾丁質(zhì)為唯一碳源，分別以2%蛋白胨、2%牛肉膏、2%硫酸銨、2%硝酸銨為氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)72 h，測(cè)酶活，結(jié)果見圖5。

圖5 氮源對(duì)菌株X產(chǎn)酶的影響

由圖5可知，菌株X在以蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基中產(chǎn)酶情況最好，酶活達(dá)1.10 U·mL-1。其次是牛肉膏。以硫酸銨、硝酸銨為氮源時(shí)產(chǎn)酶較差，說(shuō)明菌株X在有機(jī)氮源中易產(chǎn)酶，特別是對(duì)蛋白胨的利用率最高，卻不能較好地利用無(wú)機(jī)氮源。

2.6 碳源對(duì)菌株X產(chǎn)酶的影響

以2%接種量接種于以蛋白胨為唯一氮源，分別以2%細(xì)粉幾丁質(zhì)、2%膠體幾丁質(zhì)、2%葡萄糖、2%淀粉為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)72 h，測(cè)酶活，結(jié)果見圖6。

圖6 碳源對(duì)菌株X產(chǎn)酶的影響

由圖6可知,菌株X在不同碳源的培養(yǎng)基中均可產(chǎn)酶，以細(xì)粉幾丁質(zhì)、膠體幾丁質(zhì)為碳源時(shí)產(chǎn)酶較好，其中以細(xì)粉幾丁質(zhì)為碳源時(shí)最好，酶活達(dá)1.08 U·mL-1，而以葡萄糖和淀粉為碳源時(shí)產(chǎn)酶效果較差。這可能是因?yàn)榧?xì)粉幾丁質(zhì)或膠體幾丁質(zhì)可作為菌株生長(zhǎng)所需的碳源。說(shuō)明該菌株所產(chǎn)的幾丁質(zhì)酶為一種誘導(dǎo)酶，幾丁質(zhì)或其衍生物可以充當(dāng)誘導(dǎo)物[8]。而葡萄糖可能有阻遏作用。

2.7 菌株X產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

在單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了L9(34)正交實(shí)驗(yàn)對(duì)最佳產(chǎn)酶碳源(細(xì)粉幾丁質(zhì))、氮源(蛋白胨)、初始pH值和溫度之間的交互作用做了進(jìn)一步的研究。正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與分析見表3。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

由表3可以看出，各因素對(duì)產(chǎn)酶影響大小依次為D>C>A>B,即影響最大的是碳源,其次是氮源,再次是溫度,最小是pH值?？赡苁怯捎谔荚础⒌炊际蔷戤a(chǎn)酶所必需的物質(zhì)，所以影響最大。菌株X的最適產(chǎn)酶組合為A1B2C1D2，即溫度為30℃、pH值為7.0、細(xì)粉幾丁質(zhì)10 g·L-1、蛋白胨10 g·L-1。

2.8 優(yōu)化條件下菌株X的產(chǎn)酶活性

取培養(yǎng)2 d的菌種的種子培養(yǎng)液，按2%的接種量接入以10 g·L-1細(xì)粉幾丁質(zhì)為唯一碳源、10 g·L-1蛋白胨為唯一氮源的發(fā)酵培養(yǎng)液中，在pH值7.0、30℃、180 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)72 h，發(fā)酵培養(yǎng)液經(jīng)過(guò)4層紗布過(guò)濾再于6000 r·min-1離心10 min，除去沉淀,得粗酶液，測(cè)得酶活為1.24 U·mL-1、1.25 U·mL-1、1.25 U·mL-1，平均酶活約1.25 U·mL-1，比條件優(yōu)化前有較大提高。

3 結(jié)論

(1)通過(guò)平板透明圈法初篩、復(fù)篩，從土壤中獲得一株透明圈最大(透明圈與菌落直徑比2.16)、最穩(wěn)定的菌株X。根據(jù)菌株和菌落的形態(tài)以及生理生化特征，初步判斷該菌為短芽孢桿菌屬(Brevibacillusshida.Agri)。

(2)菌株X培養(yǎng)72 h 時(shí)產(chǎn)酶達(dá)高峰。單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)表明，各因素對(duì)產(chǎn)酶的影響大小依次為碳源>氮源>溫度>pH值,即影響最大的是碳源,其次是氮源,再次是溫度,最小是pH值。菌株X產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的最佳條件為：溫度30℃、pH值7.0、細(xì)粉幾丁質(zhì)10 g·L-1、蛋白胨10 g·L-1。在此優(yōu)化條件下幾丁質(zhì)酶活達(dá)1.25 U·mL-1。

參考文獻(xiàn)：

[1] 關(guān)海寧，徐桂花，刁小琴.微生物產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的研究概況及其應(yīng)用[J].中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng)，2006，(8):33-35.

[2] 鄭志成，周美英，姚炳新.蜂房芽孢桿菌B-91幾丁質(zhì)酶的合成條件[J].廈門大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，1995,34(3):447-451.

[3] 陳秀珠，蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M].北京：科學(xué)出版社，2001：58-61.

[4] 陶剛，劉杏忠，王革，等.產(chǎn)幾丁質(zhì)酶木霉生防菌株的生化測(cè)定[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2005，18(4):452-455.

[5] Miller G L.Use of dinitrosalic acid regent for determination of reducing sugar[J].Anal Chem,1959，31(3):426-428.

[6] 王海東,陳飚,倫鏡盛,等.產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株SWCH-6的篩選、鑒定及其產(chǎn)酶條件的優(yōu)化研究[J].微生物學(xué)通報(bào),2008,35(5):705-711.

[7] 張榮奎,賀淹才,劉愛花,等.土壤產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株的篩選鑒定及產(chǎn)酶條件[J].華僑大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2007,28(2):178-181.

[8] 曹軍衛(wèi),馬輝文,張甲耀.微生物工程(第二版)[M].北京:科學(xué)出版社,2007:22-50.