藻藍(lán)蛋白對(duì)2型糖尿病大鼠胰島細(xì)胞 NFκB和 IκB表達(dá)的影響*

張 蕊，馬 璇，劉 琳，劉吉東，沈 衛(wèi)

近年來倍受關(guān)注的炎癥病因?qū)W理論認(rèn)為，2型糖尿病是一種自然免疫和低度炎癥性疾病，細(xì)胞因子是導(dǎo)致代謝綜合征的主要原因，而炎癥是胰島素抵抗的觸發(fā)因素[1]。甚至在亞臨床階段，慢性炎癥就參與了胰島素抵抗綜合征的發(fā)生。在整個(gè)炎癥網(wǎng)絡(luò)中，核因子 κB（NFκB）是研究的熱點(diǎn)。NFкB 抑制蛋白（IкB）激酶（IKK）／NFκB 炎癥通路活化是導(dǎo)致胰島素抵抗和糖尿病的重要機(jī)制之一[2-3]。但對(duì)于該通路在胰島細(xì)胞中活性變化的研究，國內(nèi)鮮有報(bào)道。藻藍(lán)蛋白是螺旋藻中的一種重要活性物質(zhì)，大量文獻(xiàn)報(bào)道其能夠抗炎和調(diào)節(jié)免疫。初步體外實(shí)驗(yàn)表明，藻藍(lán)蛋白具有抗2糖尿病的作用。為此，本實(shí)驗(yàn)建立2型糖尿病大鼠模型，應(yīng)用藻藍(lán)蛋白進(jìn)行干預(yù)，研究其對(duì)胰島細(xì)胞功能的影響和IкB／NFκB通路活性變化的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型 健康雄性Wistar大鼠32只，鼠齡1個(gè)月，體質(zhì)量130 g~150 g，由青島市藥檢所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（SCXK（魯）20030010）。動(dòng)物均于實(shí)驗(yàn)前置于實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)環(huán)境1周，自由飲食，室溫（23±2）℃，自然光照，相對(duì)濕度50%~70%。1周后，24只大鼠以高糖高脂飼料（15%豬油、20%蔗糖、13%蛋黃粉、2%膽酸鈉、50%普通飼料）喂養(yǎng)，其余8只喂以普通飼料。4周后禁食12 h，高糖高脂組以30 mg/kg劑量1次性腹腔注射1%鏈脲佐菌素（STZ，美國Sigma公司）檸檬酸緩沖液，普通飼料組同步注射等量的檸檬酸緩沖液。3周后剪尾取血，測(cè)空腹血糖，以血糖值≥7.0 mmol/L為糖尿病模型建立成功，24只大鼠全部造模成功。將24只造模成功的大鼠隨機(jī)分為糖尿病模型組、藻藍(lán)蛋白組、二甲雙胍組，每組8只，其中模型組2只大鼠于實(shí)驗(yàn)第11周死亡。

1.2 干預(yù)措施 實(shí)驗(yàn)第9周開始干預(yù)治療。藻藍(lán)蛋白粉劑（由中國科學(xué)院海洋研究所提供）暗室分裝后-20℃保存，用前加蒸餾水稀釋至濃度為10%的混懸液，按500 mg/kg體質(zhì)量灌胃給藥（藻藍(lán)蛋白劑量由中國科學(xué)院海洋研究所推薦使用），1次/d，連續(xù)10 d；二甲雙胍組同步給予蒸餾水稀釋至8%濃度的二甲雙胍，以400 mg/kg連續(xù)灌胃10 d。糖尿病模型組同步給予等體積的生理鹽水，連續(xù)灌胃10d。

1.3 標(biāo)本采集及處理 治療結(jié)束后(11周初)，各組大鼠頸椎脫臼處死，迅速取胰腺，4℃生理鹽水沖洗干凈后10%甲醛固定24 h，蒸餾水浸泡4 h。常規(guī)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，LEICA2135石蠟切片機(jī)連續(xù)切片，厚度5 μm，每隔20片取1片，每個(gè)標(biāo)本取6片，分別裱于涂有多聚賴氨酸的載玻片上，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1 血糖 各組動(dòng)物分別在第造模前、造模后、治療后測(cè)空腹血糖（FBG）（mmol/L）。測(cè)空腹血糖前夜，大鼠禁食12 h，次日鼠尾靜脈取血，用自動(dòng)血糖儀（強(qiáng)生醫(yī)療器材有限公司，穩(wěn)豪型）測(cè)定空腹血糖。

1.3.2 免疫組化染色 NFκBp65和IκBα親和純化抗體、即用型SABC試劑盒、3，3-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒，均由武漢博士德生物工程有限公司提供。取上述切片置于60℃烤箱烤片1 h，常規(guī)脫蠟至水，蒸餾水浸泡2 min，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作，DAB顯色，光鏡下特異性染色為片狀棕黃色顆粒。對(duì)每批染色均同步設(shè)立以0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）液代替一抗的陰性空白對(duì)照。光學(xué)顯微鏡（400倍）下，每張切片計(jì)數(shù)100個(gè)胰島細(xì)胞，分別記錄其中的陽性細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 空腹血糖 STZ造模后，模型組、藻藍(lán)蛋白組、二甲雙胍組大鼠空腹血糖與正常組比較明顯升高（P<0.05）。經(jīng)干預(yù)治療后，藻藍(lán)蛋白組、二甲雙胍組大鼠空腹血糖與模型組比較顯著降低（P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠空腹血糖的比較（s）

表1 各組大鼠空腹血糖的比較（s）

注：與正常組比較，△P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

組別 n 劑量（mg/kg）正常組模型組藻藍(lán)蛋白組二甲雙胍組8888--500 400造模后（9周）血糖(mmol/L)3.48±0.50 9.15±3.20△9.75±1.58△9.20±0.36△治療后(11周)血糖(mmol/L)3.91±0.71 8.94±1.90△7.05±0.87*5.74±1.32*

2.2 病理形態(tài)學(xué) 正常組大鼠胰島為圓形或橢圓形著色淡淺的細(xì)胞團(tuán)，分散于胰腺腺泡之間，數(shù)量較多、形狀規(guī)則、界限清楚，胰島內(nèi)細(xì)胞排列整齊、大小一致、分布均勻，細(xì)胞核大而圓。模型組大鼠胰腺內(nèi)胰島細(xì)胞團(tuán)數(shù)量減少、分布稀疏，殘存胰島萎縮、邊緣皺縮、界限不清，胰島細(xì)胞數(shù)目減少、空泡增多，部分細(xì)胞發(fā)生融合、核溶解、聚集邊靠、有的細(xì)胞核缺失，只殘留伊紅淺染的細(xì)胞質(zhì)。藻藍(lán)蛋白組和二甲雙胍組大鼠胰島細(xì)胞病變減輕，胰島細(xì)胞團(tuán)形狀較規(guī)則，與模型組有較大改善，但與正常組相比仍有差距，見圖1。

2.3 NFκB的表達(dá) 觀察各組大鼠胰島細(xì)胞核中NFκB的染色情況。正常組大鼠只局部胰島細(xì)胞核有著色；糖尿病模型組大鼠胰島細(xì)胞核NFκB表達(dá)顯著增強(qiáng)（P<0.05），細(xì)胞核呈明顯棕黃色；藻藍(lán)蛋白和二甲雙胍干預(yù)組大鼠胰島細(xì)胞核NFκB的表達(dá)較糖尿病模型組均明顯降低（P<0.05），細(xì)胞核呈淡黃色。藻藍(lán)蛋白組與二甲雙胍組比較，無顯著性差異（P＞0.05），見表 2、圖 2。

圖1 各組大鼠胰島細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)，HE×400

表2 各組大鼠NFκB和IκB表達(dá)的比較（s）個(gè)

表2 各組大鼠NFκB和IκB表達(dá)的比較（s）個(gè)

注：與正常組比較，△P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

分組正常組模型組藻藍(lán)蛋白組二甲雙胍組n8688 NFκB 10.75±3.62 53.83±6.52△22.13±6.90△*21.50±4.93△*IκB 74.88±8.95 30.67±6.53△42.88±7.68△*43.25±6.69△*

圖2 各組大鼠胰島細(xì)胞NFκB的表達(dá)，SABC×400

2.4 IκB的表達(dá) 觀察各組大鼠胰島細(xì)胞漿中IκB的染色情況。正常組大鼠胰島細(xì)胞漿呈明顯棕黃色；糖尿病模型組大鼠胰島細(xì)胞漿中IκB表達(dá)顯著降低（P<0.05），只局部細(xì)胞有著色；藻藍(lán)蛋白和二甲雙胍干預(yù)組大鼠胰島細(xì)胞漿IκB的表達(dá)較糖尿病模型組均明顯提高（P<0.05）。藻藍(lán)蛋白組與二甲雙胍組比較，無顯著性差異（P＞0.05）（圖 3）。

圖3 各組大鼠胰島細(xì)胞IκB的表達(dá)，SABC×400

3 討論

3.1 藻藍(lán)蛋白對(duì)糖尿病大鼠胰腺中IкB/NFκB通路的影響 NFκB是一種對(duì)眾多炎癥因子的轉(zhuǎn)錄具有調(diào)控作用的蛋白質(zhì)分子。靜息狀態(tài)時(shí)，NFκB與其抑制蛋白IкB結(jié)合，以無活性的形式定位于細(xì)胞漿之中。高血糖、高游離脂肪酸、糖基化終末產(chǎn)物、感染等因素導(dǎo)致機(jī)體氧化應(yīng)激增強(qiáng)，激活I(lǐng)кB激酶（IKK）?；罨蟮腎KK使IкB降解從而與NFκB分離，NFκB移位進(jìn)入細(xì)胞核中，與DNA鏈上特異部位結(jié)合，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄[4]。多種炎癥因子和炎癥酶靶基因的轉(zhuǎn)錄，如 TNFα、IL2、IL18、NOS、COX-2 等，使得這些炎癥因子和酶過度表達(dá)，造成胰島炎性浸潤，胰島β細(xì)胞功能障礙和糖尿病及其并發(fā)癥的產(chǎn)生。大量文獻(xiàn)表明NFκB與糖尿病腎病和大血管并發(fā)癥的發(fā)生密切相關(guān)[5-7]。用NFκB的活性抑制劑吡咯烷二硫基甲酸酯（PDTC）抑制其活性能延緩糖尿病腎病的發(fā)展[8]。大鼠胰腺是STZ毒性損傷的靶器官，STZ可以通過一氧化氮和自由基等途徑損傷胰島β細(xì)胞誘發(fā)糖尿病，而自由基是激活NFκB的因素之一。由此推測(cè)，糖尿病大鼠胰腺中有IкB/NFκB通路的活化。

實(shí)驗(yàn)NFκB免疫組化結(jié)果可見，正常組大鼠胰島細(xì)胞團(tuán)中胰島細(xì)胞漿呈明顯棕黃色著色，只局部胰島細(xì)胞核有著色，而糖尿病大鼠胰島細(xì)胞團(tuán)中胰島細(xì)胞核呈明顯棕黃色著色，細(xì)胞漿幾乎不著色。IκB的免疫組化結(jié)果顯示，正常組大鼠胰島細(xì)胞漿呈深棕黃色著色，細(xì)胞核幾乎不著色，而糖尿病組大鼠胰島細(xì)胞核、漿幾乎都不著色。這體現(xiàn)了糖尿病大鼠胰島細(xì)胞中IκB被降解后，激活的NFкB從細(xì)胞漿到細(xì)胞核的轉(zhuǎn)移過程。藻藍(lán)蛋白干預(yù)組大鼠胰島細(xì)胞核NFκB表達(dá)較糖尿病組明顯減輕，而IκB表達(dá)增強(qiáng)，說明干預(yù)后IκB的活性可能有所恢復(fù)，NFκB在胰島細(xì)胞核中的表達(dá)降低。提示藻藍(lán)蛋白可能具有抑制IкB/NFκB通路活化的作用。

3.2 藻藍(lán)蛋白對(duì)糖尿病胰腺的保護(hù)作用 藻藍(lán)蛋白是螺旋藻細(xì)胞中重要的光合作用天然色素，在螺旋藻中的含量高達(dá)10%～20%。近年來國內(nèi)外人員研究表明,藻藍(lán)蛋白具有抗疲勞、抗輻射、抑制腫瘤、降低血脂、調(diào)節(jié)免疫、抗炎等多種功能且安全無毒。Romay等[9-10]第一次報(bào)道了藻藍(lán)蛋白具有抗炎、清除氧自由基的作用,他們研究證明藻藍(lán)蛋白在12種炎癥實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭斜憩F(xiàn)出抗炎效應(yīng)。藻藍(lán)蛋白可以清除烷基、羥基、過氧基,可以抑制由亞鐵離子（Fe2+）、壞血酸致微粒體脂質(zhì)過氧化，其抗氧化作用與抑制腫瘤壞死因子 α（TNFα）及一氧化碳（NO）產(chǎn)生有關(guān)[9]。二甲雙胍是應(yīng)用多年的抗2型糖尿病一線藥物，它可以抑制高糖所誘發(fā)的炎癥反應(yīng)[11]，通過抑制NFκB的活化而減弱ILβ/TNFα誘導(dǎo)的培養(yǎng)皿中血管壁細(xì)胞（EC、單核細(xì)胞等）炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，提示其具有直接的抗炎作用。但臨床上長(zhǎng)期應(yīng)用二甲雙胍會(huì)造成一定的毒副作用。本實(shí)驗(yàn)觀察到藻藍(lán)蛋白有類似二甲雙胍的作用，可明顯抑制糖尿病大鼠胰島細(xì)胞中有IкB/NFκB通路的活性，具有一定的胰島細(xì)胞保護(hù)作用，其機(jī)制可能為：減少IKK激活導(dǎo)致的IκB磷酸化和降解，抑制NFκB介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄，降低TNFα、IL2、IL6等炎癥因子的表達(dá)和NOS催化的NO表達(dá)從而減少胰島細(xì)胞炎癥；降低血脂，減輕脂質(zhì)過氧化，清除各種自由基，保護(hù)胰島細(xì)胞。藻藍(lán)蛋白可以顯著降低糖尿病大鼠的血糖，降低血糖的程度不如二甲雙胍，可能因?yàn)椋涸逅{(lán)蛋白具有獨(dú)立的、不依賴于降糖作用的抗炎、抗氧化應(yīng)激機(jī)制，藻藍(lán)蛋白的降糖作用更為緩和，故在干預(yù)期間降糖效果不如二甲雙胍。

綜上所述，藻藍(lán)蛋白表現(xiàn)出抗2型糖尿病的藥理作用且無毒副作用，因此可能成為今后新型的治療2型糖尿病的藥物或功能性食品。

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