鋱離子熒光增敏洛美沙星及其含量測(cè)定

聶松柳，戚雪勇，張懷敬，何 華

（1.安徽省六安市人民醫(yī)院藥劑科，安徽 六安 237005； 2.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212001；3.中國(guó)藥科大學(xué)分析化學(xué)教研室，江蘇 南京 210009）

洛美沙星（lomefloxacin，LFLX）是新一代廣譜氟喹諾酮類抗菌藥物，抗菌活性強(qiáng)、抗菌譜廣、不良反應(yīng)小，用于治療泌尿系統(tǒng)、呼吸道、前列腺等細(xì)菌感染性疾病，效果良好。洛美沙星的含量測(cè)定方法較多，如紫外分光光度法[1-2]、熒光分析法[3-5]、化學(xué)發(fā)光法[6]、原子吸收法[7]、高效液相色譜法[8-11]、毛細(xì)管電泳法[12]、伏安法[13]、非水滴定法[14]、微生物檢測(cè)法[15]等，但這些方法各有優(yōu)勢(shì)和不足，在簡(jiǎn)便性、靈敏性、專屬性和穩(wěn)定性等方面有待完善和提高。因此，有必要探索能同時(shí)進(jìn)行洛美沙星體內(nèi)和體外分析的新方法。

1 儀器與試藥

RF-5301PC型熒光分光光度計(jì)（日本，島津）；FTIR-8400S型紅外光譜儀（日本，島津）；FA 1004型電子天平（上海天平儀器廠）；pHS-2C型酸度計(jì)（上海雷磁儀器廠）。天門冬酸洛美沙星對(duì)照品（法國(guó)巴黎十一大藥學(xué)院贈(zèng)送）；Tb4O7（上海躍龍有色金屬有限公司）；鹽酸洛美沙星膠囊（南京第二制藥廠）；其他試劑均為分析純，水為雙蒸水（本實(shí)驗(yàn)室自制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液配制

TbCl3溶液的配制：稱取 （MTb=159，MTb4O7=748）0.074 8 g Tb4O7，滴加鹽酸（1∶1）數(shù)滴，并加入幾滴H2O2，小心加熱使其溶解，待蒸至近干，用水于100 mL量瓶中定容，配成4.0×10-3mol/L的Tb3+離子貯備液，置冰箱中保存。

洛美沙星貯備液：稱取天門冬酸洛美沙星對(duì)照品（M=466）0.046 6 g，用水于100 mL量瓶中定容，配成1.0×10-3mol/L的對(duì)照品貯備液，冰箱中保存。臨用前吸取1 mL，置100 mL量瓶中，用水定容，配成1.0×10-5mol/L的工作溶液。

醋酸-醋酸鈉緩沖液（0.1 mol/L）：將適當(dāng)體積的0.1 mol/L醋酸和適當(dāng)體積的0.1 mol/L醋酸鈉溶液混和，在酸度計(jì)上調(diào)節(jié)至所需pH。

Tris-HCl緩沖液（0.1 mol/L）：取三羥甲基氨基甲烷12.41 g，加水800 mL，攪拌溶解，并稀釋至 1 000 mL，用 6 mol/L鹽酸溶液在酸度計(jì)上調(diào)節(jié)至所需pH。

2.2 測(cè)定方法

于25 mL量瓶中依次加入洛美沙星貯備液2.5 mL、Tb3+離子溶液 1.25 mL、pH=6.0的醋酸 -醋酸鈉緩沖液2 mL，水定容，搖勻。以320 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，545 nm為發(fā)射波長(zhǎng)，用1 cm石英池，在熒光分光光度計(jì)上測(cè)定其熒光強(qiáng)度，激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5 nm。

2.3 熒光測(cè)定條件選擇

圖1 熒光光譜圖

激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)：光譜圖見(jiàn)圖1。洛美沙星在273 nm和320 nm波長(zhǎng)處有最大兩個(gè)激發(fā)波長(zhǎng)，洛美沙星與Tb3+生成絡(luò)合物后峰位基本沒(méi)有位移，且275 nm波長(zhǎng)處的強(qiáng)度明顯增大（圖1 A）。由圖1 B可見(jiàn)，洛美沙星的熒光峰位于435 nm波長(zhǎng)處，但當(dāng)它與Tb3+離子結(jié)合后，其自身435 nm波長(zhǎng)處的熒光峰則顯著減小，而在490，544，590，620 nm波長(zhǎng)處產(chǎn)生了鋱的特征熒光峰（峰形較窄），它們分別對(duì)應(yīng)于Tb3+的5D4→7F6，5D4→7F5，5D4→7F4，5D4→7F3躍遷。由 Tb3+水溶液的熒光光譜可知，Tb3+的熒光強(qiáng)度極弱。由此可見(jiàn)，Tb3+的特征熒光峰是由于洛美沙星將吸收的能量傳遞給Tb3+，從而敏化了Tb3+的發(fā)光，與Tb3+水合離子相比較極大地提高了Tb3+的發(fā)光強(qiáng)度。由圖1C可知，鋱離子本身的激發(fā)波長(zhǎng)在270～290 nm波長(zhǎng)之間，為了避免對(duì)鋱的激發(fā)，因此將絡(luò)合物的激發(fā)波長(zhǎng)選擇為315～330 nm，最終確定為320 nm。綜上所述，熒光測(cè)定條件確定為1cm石英池，激發(fā)波長(zhǎng)λex=320nm，發(fā)射波長(zhǎng) λem=545nm，狹縫均5 nm。

介質(zhì)pH確定：于25 mL量瓶中依次加入洛美沙星工作溶液2.5 mL，Tb3+離子貯備液 1.25 mL，pH 分別為 3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，8.0，9.0，10.0 的緩沖液 2 mL，以水定容，搖勻，依法測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖2。在pH較低或較高的介質(zhì)里，Tb3+與洛美沙星很難反應(yīng)；當(dāng)介質(zhì)pH為6.0～6.5時(shí)，體系的熒光強(qiáng)度達(dá)到最大并且穩(wěn)定。在堿性條件下，Tb3+易水解，生成鋱的氫氧化物沉淀；在強(qiáng)酸時(shí)，—COOH難以電離，不易形成絡(luò)合物。從理論上講，pH應(yīng)大于8.0，反應(yīng)易進(jìn)行，但會(huì)產(chǎn)生沉淀，尤其是磷酸鹽緩沖液也會(huì)產(chǎn)生TbPO4沉淀。固定pH為6.0，試驗(yàn)了不同緩沖體系醋酸-醋酸鈉、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉、Tris-鹽酸中Tb3+與洛美沙星的反應(yīng)情況，發(fā)現(xiàn)醋酸-醋酸鈉最好，適宜用量在1.5～2.0 mL之間。故本試驗(yàn)選用pH=6.0的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液2 mL。

Tb3+離子濃度確定：于25 mL量瓶中依次加入洛美沙星工作溶液 2.5 mL、醋酸 -醋酸鈉緩沖液（0.1 mol/L，pH=6.0）2 mL，分別加入 Tb3+離子貯備液 0 mL（0 倍 ）、0.1 mL（16 倍 ）、0.2 mL（32倍）、0.5 mL（80 倍）、0.8 mL（128 倍）、1.0 mL（160 倍）、1.5 mL（240倍）、2.0 mL（320 倍）、3.0 mL（480 倍）、6.0 mL（960 倍），以水定容，搖勻。依法測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖2 LFLX-Tb3+熒光的影響（1.0×10-6～2.0×10-4mol/L）

圖3 Tb3+離子濃度對(duì)LFLX-Tb3+熒光的影響

洛美沙星-鋱離子絡(luò)合物熒光強(qiáng)度受Tb3+離子濃度影響極大。Tb3+離子濃度增大，有利于配合物的形成，并使絡(luò)合物體系的熒光強(qiáng)度增大。試驗(yàn)中固定洛美沙星濃度為1.0×10-6mol/L，改變Tb3+離子濃度，發(fā)現(xiàn)隨著Tb3+離子濃度逐漸增加，在545 nm波長(zhǎng)處Tb3+離子的特征熒光強(qiáng)度逐漸增大，同時(shí)在435 nm波長(zhǎng)處洛美沙星自身的熒光強(qiáng)度逐漸減小。當(dāng)[Tb3+]/[LFLX]≥200時(shí)，體系熒光強(qiáng)度趨于恒定。

2.4 方法學(xué)考察

穩(wěn)定性試驗(yàn)：于25 mL量瓶中依次加入洛美沙星工作溶液1.25 mL、醋酸 -醋酸鈉緩沖液（0.1 mol/L，pH=6.0）2 mL、Tb3+離子貯備液 0.65 mL，水定容，搖勻。分別于放置 5，15，25，30，60，120 min時(shí)依法測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖4?？梢?jiàn)，最大熒光強(qiáng)度為289.9，最小熒光強(qiáng)度為275.7，最大改變幅度為5.15%，表明絡(luò)合物的熒光在2 h內(nèi)穩(wěn)定。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：吸取 0，0.025，0.1，0.5，1.0，2.0，3.0 mL 洛美沙星工作溶液，置25 mL量瓶中，加2.0 mL醋酸-醋酸鈉緩沖液，加1.25 mL Tb3+離子貯備液，用雙蒸水定容，配成濃度為0，1.0×10-8，4.0 ×10-8，2.0 × 10-7，4.0 × 10-7，8.0 × 10-7，1.2 × 10-6，2.4×10-6mol/L的系列溶液，放置30 s，依法測(cè)定相對(duì)熒光強(qiáng)度。以濃度為橫坐標(biāo)、熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程為F=6.448 7 ×108C-5.985 6，r=0.999 9（n=7）。結(jié)果表明，洛美沙星濃度在1.0×10-8～2.4×10-6mol/L范圍內(nèi)與熒光強(qiáng)度線性關(guān)系良好。檢測(cè)限為3.5 ng/mL。試驗(yàn)顯示，加空白血清對(duì)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線無(wú)干擾。

回收率試驗(yàn)：用標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)定回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 膠囊和血樣的回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.5 樣品測(cè)定

洛美沙星膠囊測(cè)定：取膠囊10粒（0.1 g/粒），將內(nèi)容物混勻，取相當(dāng)于1粒膠囊的藥粉，加水少許充分振搖，使藥物溶解，過(guò)濾除去不溶物，用水洗滌，合并濾液與洗液，置100 mL量瓶中，定容；從中吸取5.0 mL，置50 mL量瓶中，定容；移取0.5 mL于25 mL量瓶中，加Tb3+離子貯備液1.5 mL，0.1 mol/L醋酸-酸酸鈉（pH=6.0）緩沖液2 mL，以水定容。依法測(cè)定相對(duì)熒光強(qiáng)度，結(jié)果以百分標(biāo)示量計(jì)。結(jié)果3批樣品中洛美沙星的百分標(biāo)示量分別為98.6%，98.9%，99.4%，平均98.98%，均符合國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS-203（X-177）-96的規(guī)定。

兔血清中洛美沙星測(cè)定：取洛美沙星200 mg，加少許0.1 mol/L NaOH溶解，加水10 mL稀釋，從兔耳緣靜脈注射。分別于給藥后0.25，0.75，1.25，1.75，4.0，6.0，8.0，24.0 h 時(shí)，從兔耳緣靜脈采血 3.0 mL，靜置 1 h，離心（4 000 r/min）5 min。取血清 0.5 mL，置另一離心管中，加水 1 mL，乙腈 1 mL，離心（4 000 r/min）5 min。取上清液2 mL，置25 mL量瓶中，加Tb3+離子貯備液1.5 mL，0.1 mol/L醋酸-醋酸鈉（pH=6.0）緩沖液2 mL，以水定容。結(jié)果見(jiàn)圖 5。以logC對(duì)時(shí)間進(jìn)行線性回歸，計(jì)算半衰期（t1/2）為 1.60 h，與文獻(xiàn)[16]報(bào)道的基本一致，說(shuō)明本方法可用于洛美沙星的藥代動(dòng)力學(xué)研究。

圖5 洛美沙星的血藥濃度曲線

3 討論

鑭系元素具有在能量轉(zhuǎn)移過(guò)程中起重要作用的4f電子。在溶液中，由于游離態(tài)鑭系離子的摩爾吸收系數(shù)ε小，并受水分子光淬滅效應(yīng)的影響，其發(fā)射光很弱。但在加入光敏試劑以后，鑭系離子（Ln3+）的發(fā)射光大大增強(qiáng)[17]。在溶液中，鑭系離子的絡(luò)合物可吸收有機(jī)物（供體）在特征波長(zhǎng)處的能量，然后發(fā)射出具有鑭系離子特征波長(zhǎng)的輻射光。本試驗(yàn)利用這一“能量轉(zhuǎn)移”現(xiàn)象，將具有α-酮酸結(jié)構(gòu)的洛美沙星與鑭系離子中的鋱（Tb3+）結(jié)合，吸收外界給予的能量，再以能量轉(zhuǎn)移的形式傳給鋱（Tb3+），使之發(fā)出特征熒光，檢測(cè)該熒光強(qiáng)度即可測(cè)定洛美沙星的含量。

曾考察了pH、Tb3+濃度、乙醇、甲醇、TOPO、β-CD等影響熒光強(qiáng)度的因素，結(jié)果表明熒光強(qiáng)度受pH及Tb3+濃度的影響最大，故選擇中性條件下，[Tb3+]/[LFLX]=200測(cè)定洛美沙星。

喹諾酮類藥物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)決定了其具有良好的紫外吸收和熒光性質(zhì)，因此光譜法廣泛適用于此類藥物的分析測(cè)定。本試驗(yàn)建立的分析方法背景干擾小、專屬性和靈敏度高，樣品僅做簡(jiǎn)單的預(yù)處理，可直接應(yīng)用于洛美沙星血樣、動(dòng)力學(xué)研究和膠囊質(zhì)量分析。

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