高效液相色譜法測(cè)定華蟾素片中華蟾素毒基和脂蟾毒配基含量

王衛(wèi)鋒 ，羅紅鎖，李 捷

（1.陜西省中醫(yī)藥研究院，陜西 西安 710003； 2.陜西省長(zhǎng)武縣中醫(yī)醫(yī)院，陜西 咸陽(yáng) 713600；3.陜西中醫(yī)學(xué)院2007級(jí)研究生，陜西 咸陽(yáng) 712083）

華蟾素片系由干蟾皮制成的腸溶片，具有解毒、消腫、止痛功效，用于治療中、晚期腫瘤、慢性乙型病毒性肝炎等癥。其藥品標(biāo)準(zhǔn)中無(wú)含量測(cè)定方法[1]，不利于制劑的質(zhì)量控制。筆者采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定了華蟾素片中華蟾素毒基和脂蟾毒配基的含量，旨在為進(jìn)一步完善產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀（SSI）；N-2000色譜工作站（浙江大學(xué)）。華蟾酥毒基對(duì)照品（批號(hào)為110803-200504），脂蟾毒配基（批號(hào)為110718-200507），供含量測(cè)定用，均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；樣品（自制，批號(hào)為 2001101，20071102，20071103）；乙腈（HPLC級(jí)試劑，美國(guó)TEDIA公司）；超純水，其他試劑（分析純）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Thermo Hypersil-Keystone ODS Hypersil柱（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.5%磷酸二氫鉀溶液（用磷酸調(diào) pH 至3.2）- 乙腈（55 ∶45）；檢測(cè)波長(zhǎng)：296 nm；進(jìn)樣量：10 μL。理論塔板數(shù)按華蟾酥毒基和脂蟾毒配基計(jì)算應(yīng)分別不低于4 000。此條件下的對(duì)照品、供試品、陰性對(duì)照品溶液色譜圖見(jiàn)圖1。供試品溶液色譜中，華蟾酥毒基和脂蟾毒配基色譜峰與其他組分達(dá)到基線分離，陰性樣品不干擾樣品測(cè)定。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 溶液制備

精密稱取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥24 h的華蟾酥毒基對(duì)照品、脂蟾毒配基對(duì)照品適量，分別加甲醇使溶解，制成每1 mL含0.06 mg華蟾酥毒基和每1 mL含0.01 mg脂蟾毒配基的溶液，作為對(duì)照品溶液。取樣品20片，精密稱定，研細(xì)，取約3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液即得供試品溶液。按處方配制不含干蟾皮的陰性樣品，按供試品溶液的制備方法制得陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：分別取對(duì)照品溶液（華蟾酥毒基質(zhì)量濃度為0.1009mg/mL；脂蟾毒配基質(zhì)量濃度為 0.02448mg/mL）3，4，6，8mL，置10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻。取上述4種混合對(duì)照品溶液及原溶液按擬定的方法進(jìn)樣，記錄色譜圖，測(cè)定峰面積。以峰面積對(duì)進(jìn)樣量進(jìn)行回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。華蟾酥毒基線性方程為 Y=727 788 X+7 360，r=0.999 8（n=5）；脂蟾毒配基線性方程為 Y=734 578 X+1 377，r=0.999 8（n=5）。結(jié)果表明，華蟾酥毒基進(jìn)樣量在0.302 7～1.009 μg范圍內(nèi)、脂蟾毒配基進(jìn)樣量在0.073 44～0.244 8 μg范圍內(nèi)與峰面積值線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取同一對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，依法測(cè)定。結(jié)果峰面積的 RSD華蟾酥毒基為1.71%，脂蟾毒配基為1.50%（n=5），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，分別于 0，2，4，6，8 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果峰面積的 RSD華蟾酥毒基為2.26%（n=5），脂蟾毒配基為2.63%（n=5），表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

重現(xiàn)性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為20071101）樣品，依法制備供試品溶液并測(cè)定華蟾酥毒基、脂蟾毒配基的總含量。結(jié)果平均總含量為0.156 mg/片，RSD為1.36%（n=5），表明方法重現(xiàn)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取華蟾酥毒基對(duì)照品溶液（0.201 8 mg/mL）2，2，3，3，4，4 mL，分別置具塞錐形瓶中，再依次加入脂蟾毒配基對(duì)照品溶液（0.049 88 mg/mL）2，2，3，3，4，4 mL，揮干溶劑，分別加入已知含量的華蟾素片（批號(hào)為20071101）約1.5 g，按供試品溶液制備方法制備溶液并進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

2.4 樣品含量測(cè)定

取3批樣品，依法分別測(cè)定。結(jié)果批號(hào)為20071101，20071102，20071103樣品中華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的總含量分別為0.156，0.135，0.127 mg/片（n=3）。

3 討論

試驗(yàn)過(guò)程中比較了幾種色譜柱（Luna C18柱、Diamonsil C18柱、Hypersil ODS柱），結(jié)果以Hypersil ODS色譜柱分離效果最好；比較了0.5%磷酸二氫鉀溶液-乙腈（50∶50）和0.5%磷酸二氫鉀溶液-乙腈（55∶45）兩種流動(dòng)相（均用磷酸調(diào)pH至3.2），結(jié)果后者的分離效果好；也考察了 3 種流速（1.0，0.8，0.6 mL/min），0.8 mL/min時(shí)分析時(shí)間較短，分離效果好。

在選定的色譜條件下，華蟾酥毒基（保留時(shí)間12.208 min）與相鄰峰的分離度分別為5.513和2.096，脂蟾毒配基（保留時(shí)間13.773 min）與相鄰峰的分離度分別為2.096和1.819；理論塔板數(shù)以華蟾酥毒基計(jì)為6 613，以脂蟾毒配基計(jì)為6 739。采用HPLC法測(cè)定華蟾酥毒基和脂蟾毒配基含量，樣品處理方法簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確，有效成分分離較好，故該法可作為華蟾素片的質(zhì)量控制方法。

[1]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑（第14冊(cè)）[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，1997:31.