兩種根管沖洗方法聯(lián)合不同沖洗液對糞腸球菌作用的體外研究

陳建洪 李玲 唐倩 陸超云 黃嫻嫻

根管內(nèi)感染物質(zhì)的存在是影響根管治療質(zhì)量的重要因素之一。因此，如何有效去除根管內(nèi)的感染物質(zhì)是成功的重要前提。根管沖洗液通過機械沖刷作用以及化學(xué)溶解作用，配合有效的根管預(yù)備，可將大部分的感染物質(zhì)去除。研究［1，2］證明，不同的根管沖洗方法與沖洗液對去除感染物質(zhì)的效果不盡相同。

糞腸球菌(E.faecalis)常可在慢性持續(xù)性根尖周損害或再次治療的根管中檢測出，是根管治療的頑固菌。研究發(fā)現(xiàn)［3］，這與糞腸球菌可進入牙本質(zhì)小管，同時對營養(yǎng)缺乏的環(huán)境有極大耐受力有顯著關(guān)系。因此，如何最大程度的去除牙本質(zhì)小管內(nèi)的糞腸球菌對治療結(jié)果有很大影響。次氯酸鈉是對糞腸球菌效果較好的沖洗液［4］，然而較高濃度對根尖周組織的刺激性較大。超聲根管沖洗是近年來普遍應(yīng)用于口腔臨床的沖洗方法，與人工注射器沖洗相比，其有效性已經(jīng)越來越得到肯定［1］。另外，糞腸球菌是相對容易培養(yǎng)的細菌，利用糞腸球菌的體外根管感染模型來檢測藥物的抗菌作用已經(jīng)得到了許多學(xué)者的贊同［5］。本實驗研究目的旨在通過培養(yǎng)體外糞腸球菌的感染模型，來觀察超聲根管沖洗以及17%EDTA與不同濃度的次氯酸鈉沖洗液組合對糞腸球菌的清除效果。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選擇2009年6月至2010年1月在中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院口腔科因正畸需要減數(shù)拔牙的健康單根前磨牙58例，患者年齡:14～22歲。納入標準:單直通暢根管，根尖孔均發(fā)育完全，無近髓齲壞或近髓充填體，未做過牙髓治療，無根尖吸收、根裂等其他缺陷。

1.2 離體牙預(yù)備 將實驗牙去除根周軟組織、牙石等，清洗干凈后置于生理鹽水中4℃冰箱保存?zhèn)溆?。切除牙冠，保留牙根長度為15mm。常規(guī)消毒拔髓，采用Protaper器械冠向下法進行根管預(yù)備，首先用鎳鈦擴孔鉆敞開根管口，按照S1、S2、F1、F2、F3的順序進行根管預(yù)備至 30#(04 錐度)，根管預(yù)備過程中每換一次器械用0.9%NaCl2ml勻速沖洗，時間為1min。預(yù)備完畢后，根尖孔及以上2mm區(qū)域用環(huán)氧樹脂(日本株式會社)封閉。高溫高壓消毒30min備用。隨機選取2個標本置于裝有5ml新鮮配制的無菌牛心腦浸液(brain heartinfusionbroth，BHI，Sigma 公司)培養(yǎng)液的試管內(nèi)，每天更換新鮮培養(yǎng)液，通過分光光度計檢測A值觀察培養(yǎng)液渾濁度以確定消毒效果。

1.3 感染模型的建立 將保存于-70℃冰箱中的糞腸球菌(標準株ATCC29212)解凍復(fù)蘇后，接種于新鮮配制的BHI培養(yǎng)基中，37℃厭氧條件下培養(yǎng)24h。用生理鹽水稀釋，使菌液密度為3×108CFU/ml，與麥氏比濁管一致。將配制好的菌液以200UL/根管接種到56顆離體牙中，10min內(nèi)操作完畢。將標本放于盛有BHI培養(yǎng)基的24孔板中，37℃下CO2孵育箱中孵育培養(yǎng)21d，隔日更換一次新鮮培養(yǎng)菌液。并隨機抽取任一標本菌液進行微生物檢測，根據(jù)菌落形態(tài)、革蘭染色、觸酶試驗，確定無雜菌污染后則繼續(xù)實驗，若發(fā)現(xiàn)污染，則實驗立即終止。

1.4 實驗分組:按照隨機數(shù)字表分別采用超聲根管沖洗法以及人工注射器沖洗法進行根管沖洗，每組根據(jù)沖洗液的不同分為四小組，分別為17%EDTA+1%NaClO(A組)、17%EDTA+2.5%NaClO(B 組)、5.25%NaClO(C 組)、0.9%NaCl(D組 陽性對照組)，每組7個標本。

1.5 感染模型的取樣及細菌培養(yǎng)計數(shù)

1.5.1 第一次取樣(N1) 根管沖洗前用30#無菌紙尖按照工作長度插入根管中停留1min，吸取根管內(nèi)液，立即放入裝有1ml生理鹽水的Eppendorf管中混勻，分別接種于BHI血瓊脂平皿上，37℃下CO2孵育箱中培養(yǎng)，48h后計數(shù)菌落數(shù)(CFU/ml)，記為樣本 N1。

1.5.2 第二次取樣(N2) 手動不銹鋼K銼繼續(xù)預(yù)備根管中下段至50#，每更換一次器械時分別以A、B、C、D組液配以兩種沖洗方法進行根管沖洗，詳見1.6。最后用2ml無菌生理鹽水沖洗根管，以避免沖洗液的過度作用。立即用30#無菌紙尖按照根管長度插入根管中停留1min，吸取根管內(nèi)液送培養(yǎng)計數(shù)，記為樣本N2。

1.6 沖洗方法 超聲根管沖洗組:在超聲治療儀(法國賽特力公司)上用30號超聲根管銼按照根管長度放入根管，后退2mm，不做旋轉(zhuǎn)及提拉動作，盡量避免接觸根管壁，4ml各組沖洗液(A、B組 EDTA、NaClO各2ml)超聲振動沖洗1min;人工注射器沖洗組:使用5ml注射器針管和1ml側(cè)向開口的注射器針頭，沖洗時將注射器針頭沿根管側(cè)壁放入根管深部，達工作長度后后退2mm，以無阻力，不嵌塞，回流通暢為準，并不時上下，左右移動針頭，4ml各組沖洗液(A、B組 EDTA、NaClO各2ml)勻速緩慢沖洗，速度為4ml/min。

1.7 細菌菌落計數(shù) 用取樣槍取Eppendorf管中液體0.5 ml，10倍系列稀釋，接種于BHI培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)48h之后計數(shù)菌落形成單位(CFU)。

1.8 細菌復(fù)蘇實驗 第二次取樣后，在根管內(nèi)分別插入四根飽含BHI液體培養(yǎng)基的紙尖，37℃下CO2孵育箱中培養(yǎng)72h后夾出紙尖放入BHI液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)48h，肉眼見培養(yǎng)基變渾濁并根據(jù)菌落形態(tài)、革蘭染色實驗以及觸媒實驗來確定是否有其他微生物感染。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析 將細菌計數(shù)結(jié)果按lg(CFU/ml)做對數(shù)轉(zhuǎn)換，利用方差分析做統(tǒng)計學(xué)處理。見表1。

表1 兩種沖洗方法及不同沖洗液對糞腸球菌的作用

2 結(jié)果

通過單因素分析方差分析(One-wayANOVA)，無論在超聲根管沖洗組或是在人工注射器沖洗組，A、B、C、D四組中的糞腸球菌量在沖洗前均無顯著差異(超聲組F=1.7758，P=0.1786＞0.05;人工組 F=1.2748，P=0.3054＞0.05)。而各組沖洗后的細菌量與沖洗前均存在顯著差異(超聲組F=168.7702P=0.0000 ＜0.05;人工組 F=180.5105，P=0.0000＜0.05)。其中，A、B、C三組沖洗液與陽性對照組D組相比，均存在顯著性差異(P＜0.05)，見表2。同時，A、B、C三組的差值兩兩比較，B組與 A、C組均存在顯著差異(P＜0.05)，而A、C組之間無顯著差異(P＞0.05)，見表3。將超聲根管沖洗與人工注射器沖洗相比較，發(fā)現(xiàn)在A組與C組中，兩種方法存在顯著的差異，前者明顯優(yōu)于后者。而在B組中，兩者無顯著差異，見表4。細菌復(fù)蘇實驗發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液變渾濁。

表2 A、B、C三組沖洗液與D組統(tǒng)計學(xué)比較

表3 A、B、C三組沖洗液兩兩對照

表4 兩種沖洗方法在不同沖洗液組中的差值

3 討論

糞腸球菌是呼吸道及腸道中的常駐菌之一，在口腔也常可檢測到，是一種重要的條件致病菌。它與久治不愈的慢性根尖周損害或經(jīng)再次治療的根管感染有顯著關(guān)系，經(jīng)PCR檢測，可達到70%左右［6］，由于其治療的復(fù)雜性，已越來越成為研究的熱點。

關(guān)于糞腸球菌的致病機制尚未完全明了，主要與以下幾個方面有關(guān)［7］:①糞腸球菌形態(tài)多樣，體積小，可進入牙本質(zhì)小管內(nèi)，同時其分泌的絲氨酸蛋白酶、明膠酶、膠原凝結(jié)蛋白可促進與牙本質(zhì)進一步結(jié)合;②糞腸球菌可以延長自身的生存周期，使分裂繁殖基本處于靜止狀態(tài)，來對抗營養(yǎng)缺乏的外界環(huán)境，一旦有足夠的營養(yǎng)物質(zhì)，饑餓細胞可迅速恢復(fù)活性;③糞腸球菌可以抑制多形核中性粒細胞向下調(diào)節(jié)α4細胞黏附分子的表達水平，導(dǎo)致多形核中性粒細胞無法針對糞腸球菌發(fā)揮作用;④在高pH值條件下仍可存活;⑤糞腸球菌與其他細菌細胞競爭形成的生物膜對其自身具有很好的保護作用;有研究表明，糞腸球菌所形成的生物膜使糞腸球菌耐受吞噬作用.抗原抗體反應(yīng)以及抗菌劑的能力比無生物膜的細菌高出一千倍。另外，糞腸球菌生物膜常存在于根管的中下段、狹窄區(qū)及死區(qū)，物理性的器械預(yù)備及根管沖洗難以完全消除感染物質(zhì)，這對于其治療增加了難度。

理想的根管消毒藥物應(yīng)滿足以下條件［8］:①較強的抗菌效果;②有效溶解有機組織;③去除根管涂層;④對根尖周組織無毒性。目前，尚無一種理想的消毒藥物能完全殺滅糞腸球菌。樟腦氯酚雖然殺菌效果較強，然而以其為代表的苯酚類藥物由于可能具有致畸、致突變的副作用，已不推薦使用;同時臨床上經(jīng)常使用的消毒藥物氫氧化鈣已經(jīng)證明了對其效果不佳［9］;近年來，有關(guān)實驗［10］認為中藥制劑五倍子水提取物對糞腸球菌的殺菌效果較好，同時其毒副作用小，不易產(chǎn)生耐藥性，但是關(guān)于其確切療效尚在進一步研究中。

次氯酸鈉經(jīng)研究證明對糞腸球菌具有很好的療效［11］，同時可以溶解有機殘髓。但是由于不能有效去除玷污層，其表面張力亦同時抑制了進入牙本質(zhì)小管的能力。而EDTA可與金屬鈣離子形成易溶的螯合物，軟化根管牙本質(zhì)，達到脫礦消除玷污層及牙本質(zhì)碎屑的效果，兩者聯(lián)合應(yīng)用，可達到相互補償相互增效的作用［12］。本文分別選擇17%EDTA+1%Na-ClO、17%EDTA+2.5%NaClO、5.25%NaClO 與生理鹽水做對照，發(fā)現(xiàn)三者抑制糞腸球菌的能力均明顯高于對照組，說明次氯酸鈉對糞腸球菌具有較好的作用。三組沖洗液對比研究中發(fā)現(xiàn)，17%EDTA+2.5%NaClO組明顯優(yōu)于其他兩組，這與劉漪等［13］的實驗結(jié)果相類似。而17%EDTA+1%NaClO與5.25%NaClO效果無明顯差異，證明EDTA與NaClO聯(lián)合應(yīng)用，其效果優(yōu)于單獨用 NaClO來進行根管沖洗。研究證明［14］，次氯酸鈉的殺菌效果隨著濃度的升高而增強。而其細胞毒性亦與濃度成正比，高濃度的次氯酸鈉可造成根尖周組織劇烈的疼痛、腫脹和出血?？紤]到抑菌和根尖周組織反應(yīng)的雙重效應(yīng)，從本文試驗結(jié)果看，17%EDTA+2.5%NaClO為推薦使用的沖洗組合。

與傳統(tǒng)的人工注射器沖洗方法相比，超聲根管沖洗通過超聲的熱效應(yīng)、聲流效應(yīng)和“空穴效應(yīng)”來作用于根管，尤其是加上“超聲協(xié)同系統(tǒng)”大量的液體交換，可使沖洗液中有效的殺菌成份得到補充，從而獲得高效的沖洗和清理效果。本實驗A、C兩組中，兩種沖洗方法后的糞腸球菌量比較有明顯統(tǒng)計學(xué)意義，說明超聲根管沖洗對清除糞腸球菌有明顯效果，這可能與超聲聲流效應(yīng)，能夠有效地溶解和松解根管內(nèi)的壞死組織，使側(cè)副根管和牙本質(zhì)小管內(nèi)的細菌進入主根管，徹底清除附著在根管壁上的污染層有關(guān)［1］。同時由于糞腸球菌生物膜位于根管中下段、死區(qū)、狹窄區(qū)，普通的人工注射器沖洗難以到達，因此減弱了對糞腸球菌的抑制作用。而B組中，兩種沖洗方法無顯著性差異，這可能與17%EDTA+2.5%NaClO本身的抑菌效果較強，沖洗后菌量較少而無統(tǒng)計學(xué)意義有關(guān)。

本文實驗結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，在陽性對照組D組中，沖洗后與沖洗前的細菌量相比亦有統(tǒng)計學(xué)意義。說明根管預(yù)備對于去除糞腸球菌也有一定的效果。由于糞腸球菌一般位于根管中下段，因此在常規(guī)根管預(yù)備后，需繼續(xù)擴大根管中下段以清除進入牙本質(zhì)小管中的糞腸球菌。而細菌培養(yǎng)實驗發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液變渾濁，證明根管清理后仍然有細菌的存在，說明上述根管預(yù)備方法配合沖洗液尚不能完全去除糞腸球菌。

綜上所述，次氯酸鈉對于糞腸球菌具有一定的抑菌效果，而聯(lián)合EDTA使用，優(yōu)越性更加顯著。本文實驗結(jié)果推薦使用17%EDTA+2.5%NaClO作為清除糞腸球菌的根管沖洗液。另外，相對于人工注射器沖洗而言，超聲根管沖洗去除糞腸球菌的能力更明顯。因此對于難治性的感染根管或再治療的根管而言，推薦使用超聲根管沖洗以取得比較好的療效。

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