活性氧在EGCG誘導(dǎo)人胃癌MGC803細(xì)胞凋亡中的作用

鄒少娜 林敏 伍石華 王化修 羅招陽(yáng)

1.邵陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校病理教研室，湖南 邵陽(yáng) 422000；2. 邵陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校附屬醫(yī)院內(nèi)科，湖南 邵陽(yáng) 422000；3. 南華大學(xué)腫瘤研究所，湖南 衡陽(yáng) 421001

活性氧在EGCG誘導(dǎo)人胃癌MGC803細(xì)胞凋亡中的作用

鄒少娜1林敏2伍石華1王化修1羅招陽(yáng)3

1.邵陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校病理教研室，湖南 邵陽(yáng) 422000；2. 邵陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校附屬醫(yī)院內(nèi)科，湖南 邵陽(yáng) 422000；3. 南華大學(xué)腫瘤研究所，湖南 衡陽(yáng) 421001

背景與目的：表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）抗腫瘤作用的機(jī)制目前尚不十分清楚，本研究旨在探討活性氧（reactive oxygen species，ROS）在EGCG誘導(dǎo)人胃癌MGC803細(xì)胞凋亡中的作用。方法：采用噻唑藍(lán)比色法（MTT）檢測(cè)MGC803細(xì)胞的存活率；采用熒光顯微鏡觀察MGC803細(xì)胞的凋亡率；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MGC803細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞內(nèi)活性氧水平。結(jié)果：EGCG可誘導(dǎo)MGC803細(xì)胞凋亡，細(xì)胞內(nèi)活性氧水平升高。抗氧化劑N-乙酰-L-半胱氨酸（N-acetyl-L-cystein，NAC）干預(yù)后，EGCG抑制MGC803細(xì)胞生長(zhǎng)的作用明顯減弱，細(xì)胞凋亡率下降，NAC抑制了細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的升高。結(jié)論：EGCG可誘導(dǎo)MGC803細(xì)胞凋亡，該作用可被NAC顯著抑制，提示EGCG誘導(dǎo)MGC803細(xì)胞凋亡與細(xì)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生增加有關(guān)。

胃腫瘤； 表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯； 活性氧； 細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起著非常重要的作用，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是各種抗癌藥物發(fā)揮作用的共同途徑之一。表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）是綠茶中含量最為豐富的茶多酚，且活性最強(qiáng)，被認(rèn)為是21世紀(jì)最具有應(yīng)用前途的抗氧化劑和抗癌藥物之一［1］。研究表明，EGCG可在體內(nèi)外抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［2-5］，但作用機(jī)制尚不十分明確。胃癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，化學(xué)治療在胃癌治療中占有很重要的地位，但存在一定的不良反應(yīng)和耐藥性。

活性氧（reactive oxygen species，ROS）是體內(nèi)存在的一類氧的單電子還原產(chǎn)物，包括超氧陰離子過(guò)氧化氫、羥基和自由基等。在許多誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中ROS水平的激增已被證實(shí)是引起細(xì)胞凋亡的重要途徑之一，其變化甚至早于細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變［6］。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，EGCG可能通過(guò)激活p38MAPK通路使部分人胃癌MGC803細(xì)胞凋亡［7］。本研究在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討ROS在EGCG誘導(dǎo)人胃癌MGC803細(xì)胞凋亡中的作用。為EGCG應(yīng)用于胃癌的臨床治療提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng) 人胃低分化黏液腺癌細(xì)胞MGC803，由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心引進(jìn)。用含10%新生牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%且飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)傳代。

1.2 藥品與試劑 EGCG為Sigma公司產(chǎn)品，純度95%；小牛血清為杭州四季青生物工程公司產(chǎn)品；MTT為Amresco公司產(chǎn)品；吖啶橙、溴化乙錠為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品，使用終質(zhì)量濃度為100 μg/mL PBS，4 ℃避光保存；2’,7’-二氯氫化熒光素二脂(2’, 7’-Dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA)，N-乙酰-L-半胱氨酸（NAcetyl-L-cysteine，NAC）購(gòu)自Sigma公司。

1.3 MTT比色法測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種于96孔板，每孔180 μL（含0.9×104細(xì)胞），培養(yǎng)6 h后處理細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分為4組：空白對(duì)照組；10 μmol/L NAC組；120 μmol/L EGCG組（通過(guò)前期的研究表明，此濃度對(duì)MGC803細(xì)胞生長(zhǎng)抑制效應(yīng)穩(wěn)定）；10 μmol/L NAC加120 μmol/L EGCG組。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL，再培養(yǎng)4 h后小心吸去全部上清液，每孔加入200 μL二甲基亞砜，振蕩搖勻，使結(jié)晶充分溶解。置酶聯(lián)免疫儀上在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)各孔吸光度（A）值，按下列公式計(jì)算抑制率（inhibitory rate，IR）：IR=（1-A處理組平均值/A對(duì)照組平均值）×100%。

1.4 熒光顯微鏡觀察 不同藥物（分組同MTT比色法）處理MGC803細(xì)胞24 h后收集細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化制成單細(xì)胞懸液，取95 μL的細(xì)胞懸液，加入5 μL的吖啶橙/溴化乙錠貯存液混勻。吸一滴混合液點(diǎn)在潔凈玻片上，直接用蓋玻片封片，置于熒光顯微鏡下觀察并照相，分別計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞。細(xì)胞凋亡指數(shù)（%）=［（早期凋亡細(xì)胞＋晚期凋亡細(xì)胞）/全部細(xì)胞 ］×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 PI染色流式細(xì)胞術(shù)分析 不同藥物（分組同MTT比色法）處理MGC803細(xì)胞24 h后收集細(xì)胞，用4 ℃ 70%乙醇溶液固定，-20 ℃冰箱保存。檢測(cè)前用PBS洗滌細(xì)胞3次，加RNA酶消化，碘化丙啶染色，流式細(xì)胞儀（型號(hào)為FACS420）測(cè)定，分析凋亡率。

1.6 細(xì)胞內(nèi)ROS含量的檢測(cè) DCFH-DA是一種自身不產(chǎn)生熒光的化合物，它能自由地通過(guò)細(xì)胞膜，在細(xì)胞內(nèi)被ROS氧化為 2’，7’-二氯熒光素 (dichlorofluorescein, DCF)。DCF能發(fā)出很強(qiáng)的熒光，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)出的熒光強(qiáng)度間接反映了細(xì)胞內(nèi)ROS水平，并呈現(xiàn)出正相關(guān)性。

藥物處理MGC803細(xì)胞后收集細(xì)胞，參照文獻(xiàn)［8］方法，采用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS水平。用Hank’s液洗滌細(xì)胞2次，加入400 μL終濃度為10 μmol/L的DCFH-DA，充分混勻，在37 ℃條件下避光反應(yīng)50 min，用Hank’s液洗滌細(xì)胞3次以去除細(xì)胞外熒光劑，用500 μL Hank’s液重懸細(xì)胞，37 ℃條件下水浴10 min．流式細(xì)胞儀分析熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)530 nm。

1.7 統(tǒng)計(jì)處理 結(jié)果采用表示，數(shù)據(jù)采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較用單因素方差（One-way ANOVA）分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MTT比色法測(cè)定細(xì)胞活性 MTT比色法測(cè)定結(jié)果表明，10 μmol/L NAC單獨(dú)使用時(shí)無(wú)明顯抑制MGC803細(xì)胞增殖的作用(P>0.05)；120 μmol/L EGCG對(duì)MGC803細(xì)胞的抑制率為61.30 %（P＜0.05），而與NAC合用后，能減弱EGCG的抑制作用，使抑制率從61.30%降到34.50%（P<0.05）。

2.2 熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡 熒光顯微鏡下觀察MGC803細(xì)胞發(fā)生凋亡的個(gè)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)。結(jié)果表明，10 μmol/ L NAC單獨(dú)使用對(duì)MGC803細(xì)胞 ［細(xì)胞凋亡指數(shù)為（2.02±0.48）%］，沒(méi)有明顯影響 ［對(duì)照組細(xì)胞凋亡指數(shù)為（1.94±0.36）%］（P＞0.05），120 μmol/ L EGCG處理MGC803細(xì)胞48 h后，細(xì)胞凋亡指數(shù)為（26.70±3.82）%，明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）。但與NAC合用后細(xì)胞凋亡指數(shù)下降到（15.24±1.80）%（P＜0.05）（圖1）。熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)EGCG處理后的MGC803細(xì)胞皺縮呈圓形，細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核呈紅色，且細(xì)胞核皺縮或碎裂。

2.3 PI染色流式細(xì)胞術(shù)分析 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示：10 μmol/L NAC單獨(dú)使用對(duì)MGC803細(xì)胞的凋亡率無(wú)顯著影響［凋亡率為（1.9±0.08）%，P＞0.05］，120 μmol/L EGCG處理MGC803細(xì)胞24 h后，細(xì)胞凋亡率為21.50±1.80%，明顯高于對(duì)照組［凋亡率為（1.30±0.10）%，P＜0.05］，出現(xiàn)Sub-G1峰，說(shuō)明EGCG具有誘導(dǎo)MGC803細(xì)胞凋亡的作用。但與N A C合用后細(xì)胞凋亡率下降到（16.8±1.64）%（P＜0.05，圖2）。

2.4 細(xì)胞內(nèi)活性氧檢測(cè) 120 μmol/L EGCG分別處理MGC803細(xì)胞1、6、12和24 h后，細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度分別為23.72±2.30、62.10±4.50、53.80±3.50和40.20±4.20，與對(duì)照組 7.80±0.12 相比，各組均高于其熒光強(qiáng)度（P<0.05）。10 μmol/L NAC單獨(dú)使用對(duì) MGC803細(xì)胞內(nèi) ROS水平?jīng)]有明顯影響，但與EGCG合用后，檢測(cè)熒光值為25.50±2.30，能抑制EGCG處理后MGC803細(xì)胞的ROS水平（P<0.05）。

3 討 論

ROS是氧代謝過(guò)程中產(chǎn)生的一些中間產(chǎn)物，具有高度的化學(xué)活性，其對(duì)于細(xì)胞增殖分化凋亡的調(diào)控、胚胎的正常發(fā)育和機(jī)體的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)具有重要的意義。目前研究發(fā)現(xiàn)，一些抗癌藥物如順鉑、紫杉醇和三氧化二砷等在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化、凋亡的過(guò)程中，均可檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)ROS明顯的增高［9-10］。

本研究檢測(cè)了抗氧化劑NAC，在EGCG抑制MGC803細(xì)胞生長(zhǎng)和促進(jìn)其凋亡中的作用。流式細(xì)胞儀檢測(cè)表明，EGCG能夠持續(xù)激活ROS。MTT比色法、熒光顯微鏡觀察、流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果證明，用NAC抑制 ROS 的活性后，EGCG引起的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制、誘導(dǎo)凋亡作用均被減弱。提示EGCG誘導(dǎo)MGC803細(xì)胞凋亡與細(xì)胞內(nèi) ROS 產(chǎn)生增加有關(guān)。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果與以往文獻(xiàn)相符［11-12］。EGCG使MGC803細(xì)胞 ROS水平升高的具體作用機(jī)制目前尚不清楚。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著EGCG作用MGC803細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi) ROS 含量增加，提示EGCG可通過(guò) ROS 增加誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)還提示，雖然通過(guò)抗氧化劑 NAC可以逆轉(zhuǎn)EGCG的凋亡誘導(dǎo)作用，但這種逆轉(zhuǎn)作用不是完全的。因此細(xì)胞內(nèi) ROS 產(chǎn)生增加不是EGCG誘導(dǎo)MGC803細(xì)胞凋亡的唯一機(jī)制，可能還有其它機(jī)制參與了作用，需進(jìn)一步研究。總之，EGCG抑制MGC803細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)MGC803細(xì)胞凋亡的作用與細(xì)胞內(nèi) ROS 產(chǎn)生增加有關(guān)。

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The role of reactive oxygen species in epigallocatechin-3-gallate-induced apoptosis of human gastric cancer MGC803 cells

ZOU Shao-na,LIN Min,WU Shi-hua,WANG Hua-xiu,LUO Zhao-yang(Department of Pathology, Shaoyang Medical College, Shaoyang Hunan 422000, China)

LUO Zhao-yang E-mail：hylzy2008@126.com

Background and purpose：Anticancer mechanism of epigallocatechin-3-gallate (EGCG) remains unclear. This study investigated the role of reactive oxygen species (ROS) in epigallocatechin-3-gallate (EGCG)-induced apoptosis in human gastric cancer MGC803 cells.Methods：The inhibition of MGC803 cells growth was measured by MTT assay. Apoptosis of MGC803 cells was studied by using the AO/EB fl uorescence stain. Flow cytometry was used to detect the intracellular ROS level and the rate of apoptosis.Results：EGCG could induce apoptosis of MGC803 cells and increased in the intracellular ROS level. However, after treatment with N-acetyl-L-cystein and an athiolcontaining antioxidant, the inhibitory effect of EGCG on MGC803 cells was significantly weakened. The apoptotic rate of the cells and the activity of the intracellular ROS level also decreased dramatically.Conclusion：EGCG can induce apoptosis of MGC803 cells. In turn, the ROS inhibitor can significantly inhibit the apoptosis induced by EGCG in MGC803 cells. These results suggest that the cellular generation of ROS plays a role in initiating EGCG-mediated apoptosis of MGC803 cells.

stomach neoplasms; epigallocatechin-3-gallate; reactive oxygen species; apoptosis

R73-36+1；R735.2

A

1007-3639(2010)05-0344-04

邵陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校校級(jí)課題（項(xiàng)目編號(hào)：XK200808）。

羅招陽(yáng) E-mail:hylzy2008@126.com

book=334477,ebook=351

2010-01-12

2010-04-12）