蛋白4.1家族在不同乳腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)與定位

閆紅霞 時(shí)曉芳 孔超 郭歡 高艷鋒 祁元明汲振余 陳鯉翔 安秀麗 康巧珍

鄭州大學(xué)生物工程系，河南 鄭州 450001

蛋白4.1家族在不同乳腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)與定位

閆紅霞 時(shí)曉芳 孔超 郭歡 高艷鋒 祁元明汲振余 陳鯉翔 安秀麗 康巧珍

鄭州大學(xué)生物工程系，河南 鄭州 450001

背景與目的：目前，已在多種人類腫瘤中發(fā)現(xiàn)蛋白4.1家族成員表達(dá)異常。本研究旨在通過檢測(cè)蛋白4.1家族成員（4.1R/B/G/N）在3株轉(zhuǎn)移能力不同的人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、T-47D和MDA-MB-231中的表達(dá)和定位，探討蛋白4.1家族成員與乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力之間的關(guān)系。方法：采用Western blot檢測(cè)蛋白4.1家族成員在MCF-7、T-47D和MDA-MB-231細(xì)胞中的表達(dá)；免疫熒光標(biāo)記對(duì)蛋白4.1家族成員在3株細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)行定位。結(jié)果：4.1R/B/G在3種細(xì)胞系中均有表達(dá)，在T-47D細(xì)胞中的表達(dá)量均明顯高于在MCF-7細(xì)胞中的表達(dá)量（P＜0.05）；但在高轉(zhuǎn)移性的MDA-MB-231細(xì)胞中它們的表達(dá)水平轉(zhuǎn)而下降。4.1N在T-47D細(xì)胞中的表達(dá)量明顯低于在MCF-7細(xì)胞中的表達(dá)量（P＜0.01），而在MDA-MB-231細(xì)胞中的表達(dá)則幾乎檢測(cè)不到，提示4.1N表達(dá)下調(diào)或缺失與乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)。4.1R/B/G/N在MCF-7和T-47D細(xì)胞中均主要定位于細(xì)胞膜及胞間連接處，同時(shí)4.1B在細(xì)胞核中也有表達(dá)；而在高轉(zhuǎn)移的MDA-MB-231細(xì)胞中蛋白4.1家族成員均定位于細(xì)胞質(zhì)中，提示蛋白4.1家族成員亞細(xì)胞定位的改變可能是乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中的重要事件。結(jié)論：4.1N表達(dá)缺失和蛋白4.1家族成員亞細(xì)胞定位的改變與乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的高轉(zhuǎn)移性密切相關(guān)。

蛋白4.1； MCF-7； T-47D； MDA-MB-231； 轉(zhuǎn)移

2 結(jié) 果

2.1 Western blot檢測(cè)蛋白4.1家族成員在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá) 檢測(cè)結(jié)果提示，蛋白4.1R/B/G在3種乳腺癌細(xì)胞中均有表達(dá)。其中，4.1R在MCF-7細(xì)胞和T-47D細(xì)胞中存在2種形式，相對(duì)分子質(zhì)量分別約為100×103和80×103，而在MDA-MB-231細(xì)胞中只有相對(duì)分子質(zhì)量80×103蛋白表達(dá)；4.1B的相對(duì)分子質(zhì)量約為60×103；4.1G除了在3株細(xì)胞中都有一條相對(duì)分子質(zhì)量約為72×103的蛋白表達(dá)外，在低轉(zhuǎn)移性的MCF-7細(xì)胞中還檢測(cè)到了一條相對(duì)分子質(zhì)量約為100×103的蛋白表達(dá)。蛋白4.1N在MCF-7和T-47D細(xì)胞中均有表達(dá)相對(duì)分子質(zhì)量約為100×103，而在MDA-MB-231細(xì)胞中基本不表達(dá)（圖1）。

灰度掃描結(jié)果顯示，4.1R、4.1B和4.1G在T-47D細(xì)胞中的表達(dá)均顯著高于在MCF-7細(xì)胞中的表達(dá)量（P<0.05），但在MDA-MB-231中的表達(dá)量下降。其中，4.1R在MDA-MB-231中的表達(dá)與MCF-7細(xì)胞相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；4.1B和4.1G在MDA-MB-231中的表達(dá)則呈現(xiàn)出相反結(jié)果，分別高于和低于在MCF-7細(xì)胞中的表達(dá)（P<0.05）。4.1N在T-47D細(xì)胞中的表達(dá)急劇下降（P<0.01），而在MDA-MB-231細(xì)胞中的表達(dá)則幾乎完全缺失（圖2）。

2.2 免疫熒光法檢測(cè)蛋白4.1在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)定位

2.2.1 4.1R在轉(zhuǎn)移能力不同的3種乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)定位 4.1R 在MCF-7細(xì)胞中主要表達(dá)在細(xì)胞膜上及細(xì)胞-細(xì)胞間連接處，細(xì)胞質(zhì)不表達(dá)；在T-47D細(xì)胞中也定位于細(xì)胞膜上及細(xì)胞-細(xì)胞間連接處；而高轉(zhuǎn)移性MDA-MB-231細(xì)胞中主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞核中不表達(dá)（圖3A）。

2.2.2 4.1B在轉(zhuǎn)移能力不同的3種乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)定位 在MCF-7和T-47D細(xì)胞中，4.1B主要定位在細(xì)胞-細(xì)胞間連接處、細(xì)胞質(zhì)膜上，甚至細(xì)胞核上、細(xì)胞質(zhì)中也可見少量表達(dá)；在MDA-MB-231細(xì)胞中則主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞核內(nèi)不表達(dá)（圖3B）。

2.2.3 4.1G在轉(zhuǎn)移能力不同的3種乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)定位 4.1G在MCF-7細(xì)胞中主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)膜和細(xì)胞-細(xì)胞間連接處；在T-47D細(xì)胞中主要定位在細(xì)胞膜上，細(xì)胞質(zhì)中也有少量表達(dá)；而在MDA-MB-231細(xì)胞中主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核中不表達(dá)（圖3C）。

2.2.4 4.1N在轉(zhuǎn)移能力不同的3種乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)定位 在MCF-7和T-47D細(xì)胞中4.1N主要定位于細(xì)胞膜附近，在高轉(zhuǎn)移細(xì)胞MDAMB-231細(xì)胞中僅可在胞質(zhì)部分觀察到非常微弱的表達(dá)信號(hào)，這與Western blot的檢測(cè)結(jié)果一致（圖3D）。

3 討 論

腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的連續(xù)的多步驟過程，包括因腫瘤細(xì)胞間黏附能力的降低而從原發(fā)位置的脫落、癌細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)和基膜的降解與破壞、細(xì)胞骨架重構(gòu)引起的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)與侵襲轉(zhuǎn)移，最后在繼發(fā)位點(diǎn)形成新的克隆。作為細(xì)胞骨架成分的蛋白4.1家族在保持細(xì)胞與細(xì)胞，細(xì)胞與基質(zhì)間的相互作用以及細(xì)胞骨架的組織構(gòu)成方面有重要作用，并且細(xì)胞黏附作用和相關(guān)信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)也受到連接細(xì)胞膜和細(xì)胞骨架的蛋白4.1的影響，提示蛋白4.1的表達(dá)和定位可能與腫瘤的轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性。

目前，已在腦膜瘤［11］、室管膜瘤［12］、食管小細(xì)胞癌［13］、非小細(xì)胞肺癌［14］、肺小細(xì)胞癌［15］和結(jié)直腸癌［16］等多種腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)蛋白4.1表達(dá)水平的下調(diào)或缺失。而且，蛋白4.1家族成員之一4.1B已被證實(shí)為一種腫瘤抑制因子，其可與CD44結(jié)合，參與正常細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖調(diào)控［9］。在乳腺癌細(xì)胞株MCF-7中，外源4.1B的表達(dá)已被證實(shí)可以增加細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的黏附性［10］。因此，探討蛋白4.1的表達(dá)和定位與乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的關(guān)系具有重要意義。

本研究中，4.1R/B/G在3種細(xì)胞系中均有表達(dá)，而且在T-47D細(xì)胞中的表達(dá)均顯著高于在MCF-7細(xì)胞中的表達(dá)（P<0.05），但在MDAMB-231細(xì)胞中的表達(dá)轉(zhuǎn)而下降。尤其值得注意的是4.1N表達(dá)水平的變化——隨著腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力增加4.1N表達(dá)水平顯著降低，甚至在高轉(zhuǎn)移的MDA-MB-231細(xì)胞中幾乎檢測(cè)不到4.1N蛋白的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，4.1N蛋白表達(dá)下調(diào)或缺失是結(jié)腸組織惡變的早期事件。而且，在結(jié)腸癌RKO細(xì)胞中過量表達(dá)外源性4.1N蛋白能抑制細(xì)胞增殖［17］。上述結(jié)果提示4.1N蛋白可能是乳腺癌轉(zhuǎn)移的抑制因子。目前，本實(shí)驗(yàn)室擬進(jìn)一步研究4.1N蛋白與乳腺癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、增殖之間的關(guān)系，為探索乳腺癌發(fā)病、轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究提供依據(jù)。

特別值得重視的是，本研究中蛋白的亞細(xì)胞定位均表現(xiàn)出隨乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)而從細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)的現(xiàn)象，尤其是4.1R和4.1G蛋白在轉(zhuǎn)移能力不同的乳腺癌細(xì)胞中亞細(xì)胞定位的不同，提示蛋白4.1的亞細(xì)胞定位可能與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力相關(guān)。目前4.1G蛋白已被證實(shí)與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)。Rajaram等［12］研究發(fā)現(xiàn)，4.1G蛋白在室管膜瘤中的表達(dá)缺失比例達(dá)到41%。另外，Terada等［18］研究報(bào)道，采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，鼠輸精管中4.1G 定位于滋養(yǎng)層細(xì)胞，沿細(xì)胞膜分布，與鈣黏素（cadherin）共定位，說明4.1G在細(xì)胞黏附中起作用，可介導(dǎo)滋養(yǎng)層細(xì)胞和精細(xì)胞間的黏附。本研究中4.1G蛋白在不同轉(zhuǎn)移力乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)位置的不同說明，4.1G的定位可能與乳腺癌細(xì)胞的黏附/轉(zhuǎn)移能力相關(guān)。

4.1R是目前研究較多的蛋白4.1家族成員之一。Huang等［19］研究發(fā)現(xiàn)在72 例神經(jīng)細(xì)胞瘤中有14例發(fā)生4.1R基因的突變，沉默或序列改變。Victoria等［11］證實(shí)，4.1R可以與介導(dǎo)細(xì)胞遷移和黏附的CD44分子相互作用。由于CD44分子和腫瘤抑制因子merlin的相互作用已被證實(shí)介導(dǎo)了來自細(xì)胞外基質(zhì)的生長(zhǎng)抑制信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，研究者推測(cè)4.1R可能通過與腫瘤抑制因子merlin相似的方式來發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞增殖的功能。另一研究發(fā)現(xiàn)，在4.1R的FERM結(jié)構(gòu)域中存在2個(gè)腫瘤壞死因子受體p55結(jié)合位點(diǎn)，一個(gè)是由外顯子10編碼的有51個(gè)氨基酸的肽段，另一個(gè)是由外顯子5編碼的有35個(gè)氨基酸的肽段。而且，后者的缺失可使4.1R完全喪失膜定位能力［20］。因此，MDA-MB-231細(xì)胞中4.1R蛋白定位是在細(xì)胞質(zhì)中，可能意味著其未能與介導(dǎo)異質(zhì)性黏附的CD44分子、腫瘤壞死因子受體p55等相互作用，從而使細(xì)胞黏附能力降低、來自細(xì)胞外基質(zhì)的信號(hào)的傳導(dǎo)被阻斷，成為導(dǎo)致 MDA-MB-231細(xì)胞高轉(zhuǎn)移能力的關(guān)鍵原因。

可調(diào)控的可變剪接是蛋白4.1基因家族基因表達(dá)的一個(gè)基本特征，轉(zhuǎn)錄本的可變剪接可能產(chǎn)生多種4.1蛋白的異構(gòu)形式［3］。本研究中在MCF-7細(xì)胞中檢測(cè)到2條4.1G蛋白條帶可能就是可變剪接產(chǎn)生的2種異構(gòu)形式。因此，在高轉(zhuǎn)移的MDA-MB-231細(xì)胞中較大4.1R蛋白和較大4.1G蛋白的缺失以及蛋白4.1定位的改變提示，蛋白4.1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制和可變剪接調(diào)控機(jī)制可能發(fā)生了變化，與細(xì)胞膜定位相關(guān)的關(guān)鍵外顯子可能被剪除并導(dǎo)致了蛋白4.1亞細(xì)胞定位的改變。此外，蛋白的翻譯后修飾，如磷酸化，是影響蛋白4.1亞細(xì)胞定位的另一可能原因。因此，蛋白4.1細(xì)胞膜定位影響因素的分析、蛋白4.1膜定位與乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力關(guān)系的探討將是本實(shí)驗(yàn)室下一步研究的重要內(nèi)容。

綜上所述，筆者認(rèn)為4.1N表達(dá)缺失和蛋白4.1定位于細(xì)胞質(zhì)與乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的高轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)。進(jìn)一步深入研究4.1N表達(dá)水平的改變及蛋白4.1細(xì)胞定位的改變對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231轉(zhuǎn)移能力的影響及其作用機(jī)制將有助于闡明乳腺癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子機(jī)制。

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Expression and subcellular location of protein 4.1 in breast cancer cells with different metastatic capability

YAN Hong-xia,SHI Xiao-fang,KONG Chao,GUO Huan,GAO Yan-feng,QI Yuan-ming,JI Zhen-yu,CHEN Li-xiang,AN Xiu-li,KANG Qiao-zhen(Department of Bioengineering, Zhengzhou University, Zhengzhou Henan 450001, China)

KANG Qiao-zhen E-mail：qzkang@zzu.edu.cn

Background and purpose：Currently, the abnormal expression of protein 4.1 family has been noticed in several human cancers. This study aimed to investigate the correlation between the protein 4.1 family and the different metastatic capabilities of breast cancer cell lines by detecting the expression and subcellular localization of protein 4.1 family members (4.1R/B/G/N).Methods：Western blot and immunof l uorescence were used to detect the expression and subcellular location of protein 4.1 family members (4.1R/B/G/N) in breast cancer cell lines MCF-7, T-47D and MDA-MB-231.Results：Protein 4.1 family members 4.1R/B/G were detectable in 3 kinds of breast cancer cells. Their level of expression increased significantly in T-47D (P＜0.05) but declined in MDA-MB-231 with high metastasis. It is important to note that there was a very significant decline in the 4.1N expression levels in T-47D(P＜0.01), so significant that it was undetected in MDA-MB-231. This fi nding suggests a correlation between the level of expression of 4.1N and the metastatic capability of breast cancer cells. In addition, proteins 4.1R/B/G/N were mainly targeted in the membrane and cell to cell junction in MCF-7 and T-47D cells, while at the same time, 4.1B is located at the nucleus. However, all of them were only visible in the cytoplasm in MDA-MB-231. Hence, the change of protein 4.1’s subcellular location may be an important event in breast cancer cell metastasis.Conclusion：The absence of 4.1N and the change of protein 4.1’s subcellular location are both closely related to the high metastatic capability of breast cancer cell line MDA-MB-231.

蛋白4.1家族的發(fā)現(xiàn)起始于4.1R，是從人紅細(xì)胞中分離獲得的一種膜骨架蛋白，隨后又在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了3種與4.1R有很高同源性的蛋白，分別是4.1G、4.1N和4.1B，它們的典型特征是都具有3個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域，F(xiàn)ERM（4.1，Ezrin，Redixin，Moesin）、SABD（spectrin-actin binding domain）和CTD（C-terminus domain），并通過這些結(jié)構(gòu)域與多種蛋白相互作用［1］。對(duì)蛋白4.1家族進(jìn)行的早期研究證實(shí)，蛋白4.1在維持細(xì)胞形態(tài)中發(fā)揮重要作用，可以增強(qiáng)細(xì)胞骨架中spectrin與actin的相互作用，還可在spectrin-actin骨架與跨膜蛋白之間發(fā)揮連接作用［2］。隨著蛋白4.1家族與眾多跨膜蛋白之間的相互作用不斷得到證實(shí)，越來越多的研究顯示蛋白4.1家族可能參與了細(xì)胞的生長(zhǎng)調(diào)控［3］。同時(shí)，許多臨床報(bào)道表明蛋白4.1在多種腫瘤中表達(dá)缺失，如在肺癌、腦膜瘤、乳腺癌和前列腺癌等多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)了4.1B的缺失［4-9］，4.1R和4.1G也被證實(shí)參與腦部腫瘤的發(fā)生［10-11］。

本研究選取3株轉(zhuǎn)移能力不同的乳腺癌細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料。其中，MCF-7是一種雌激素受體陽性的、低侵襲低轉(zhuǎn)移的乳腺癌細(xì)胞，T-47D是一種雌激素受體陽性的、具有中度轉(zhuǎn)移能力的乳腺癌細(xì)胞，而MDA-MB-231則是一種雌激素受體陰性的、具有高侵襲性高轉(zhuǎn)移性的乳腺癌細(xì)胞。通過檢測(cè)蛋白4.1家族成員在這3種細(xì)胞系中的表達(dá)及定位，分析其與乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的關(guān)系，為尋找新的與乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因和蛋白標(biāo)志物、研究乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子機(jī)制奠定前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移提供新的治療靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株及主要試劑 人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、T-47D和MDA-MB-231購自美國(guó)典型菌種保藏庫（American Type Culture Collection，ATCC），并由本實(shí)驗(yàn)中心保藏。

兔抗人多克隆抗體（anti-4.1R19、anti-4.1BU2、anti-4.1GHP和 anti-4.1NHP）由美國(guó)紐約血液中心Dr. Xiuli An 惠贈(zèng)；GAPDH抗體購自英國(guó)Abcam公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔（二抗）為Jackson immuno Research公司產(chǎn)品；Alexa 488熒光標(biāo)記驢抗兔二抗購自Invitrogen公司；蛋白質(zhì)定量試劑盒（BCA Protein Assay Kit）購自北京奧博森公司；ECL發(fā)光試劑盒購自Thermo公司；顯影液和定影液購自北京普萊茵公司；細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM及其添加劑購自Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、T-47D和MDA-MB-231培養(yǎng)于含有10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液中（pH7.2～7.4），置于 37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞傳代，并取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 Western blot檢測(cè)蛋白4.1在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá) 分別收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的3種細(xì)胞，用預(yù)冷的蛋白裂解液裂解細(xì)胞后，按說明書操作提取細(xì)胞總蛋白，行10%SDS-PAGE分離蛋白，電泳結(jié)束后即行后60 V硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)膜2 h，以含5 %脫脂奶粉的TBST溶液封閉轉(zhuǎn)移膜2 h，加入用封閉液稀釋的一抗4.1R/B/G/N（稀釋濃度分別為1∶1 000、1∶1 500、1∶1 000和1∶500），置于搖床上，4 ℃反應(yīng)過夜。充分洗膜后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶5 000稀釋）37 ℃反應(yīng)1 h，充分洗膜，最后ECL顯色，暗室內(nèi)曝光顯影。以GAPDH蛋白為內(nèi)參同時(shí)檢測(cè)。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，并做灰度掃描，計(jì)算獲得蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 免疫熒光檢測(cè) 8孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種1×104～5×104個(gè)/孔細(xì)胞，待其生長(zhǎng)至70%~80%融合度時(shí)取出，PBS洗滌細(xì)胞3次，1% PFA（免疫細(xì)胞固定液）固定細(xì)胞15 min，再用0.25% PFA、0.1%Triton-100配制的通透液處理細(xì)胞15 min，用含10%馬血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）的封閉液封閉細(xì)胞30 min，加入一抗4.1R/B/G/N（稀釋濃度分別為，1∶2 000、1∶2 000、1∶1 000和1∶1 000）反應(yīng)1 h，PBS洗滌細(xì)胞3次各10 min，最后加入熒光標(biāo)記驢抗兔二抗（1∶700稀釋）反應(yīng)40 min，PBS再洗滌細(xì)胞3次各3 min，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞并拍照成像。

1.3 統(tǒng)計(jì)處理 采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行

protein 4.1; MCF-7; T-47D; MDA-MB-231; metastasis統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用表示，組間比較用單因素分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

R737.9

A

1007-3639(2010)05-0338-06

國(guó)家自然科學(xué)基金（項(xiàng)目編號(hào)：NO.30972707）；國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：091045922）。

康巧珍 E-mail:qzkang@zzu.edu.cn

2009-12-28

2010-02-09）