119例非小細胞肺癌患者HGFK1蛋白表達的檢測及其臨床意義

周曉輝 楊異 高宗禮 范理宏 沈贊 岳麓

1.上海交通大學醫(yī)學院附屬上海市第六人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，△心胸外科，*腫瘤內(nèi)科，上海 200233；2.青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院腫瘤科，山東 青島 266003

119例非小細胞肺癌患者HGFK1蛋白表達的檢測及其臨床意義

周曉輝1楊異△高宗禮△范理宏1沈贊*岳麓2

1.上海交通大學醫(yī)學院附屬上海市第六人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，△心胸外科，*腫瘤內(nèi)科，上海 200233；2.青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院腫瘤科，山東 青島 266003

背景與目的：研究表明，肝細胞生長因子的第一個環(huán)狀結(jié)構域基因表達產(chǎn)物（the kringle 1 domain of hepatocyte growth factor，HGFK1）能夠抑制血管生成，對于腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移有明顯的抑制作用，但是至今尚未見HGFK1蛋白在肺癌中的表達及其臨床價值的報道。本研究旨在探討非小細胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）患者中HGFK1的表達狀態(tài)及其臨床意義，從而為肺癌患者提供新的預后因子以及可能的潛在治療靶點。方法：共收集119例NSCLC患者手術切除的標本，采用Western blot技術檢測HGFK1在手術切除標本中的表達，并進一步分析HGFK1表達與患者臨床病理生理特征的關系以及和預后的關系。結(jié)果：22.7%（27/119）的NSCLC患者存在HGFK1高表達，而正常肺組織中HGFK1的高表達率為68.7%（11/16），顯著高于肺癌組織中的表達率；HGFK1基因的高表達與患者的年齡、性別、組織學類型以及吸煙狀態(tài)無關（P＞0.05），但與病理分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關；HGFK1高表達率在病理分級差（G3）的患者組織中較病理分級相對較好（G1、G2）的患者明顯降低（11.5%∶31.3%），而在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者組織中明顯較無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者低（11.6%∶38.0%）；HGFK1陽性組患者的3年無疾病進展生存時間（progress free survival，PFS）以及總生存期（overall survival，OS）均顯著長于HGFK1陰性組（P值分別為0.002和0.017）。結(jié)論：HGFK1的陽性表達率在正常肺組織中明顯高于NSCLC組織，而不同的NSCLC患者癌組織中的表達也有差別，其中，在病理分級較好、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中陽性表達率高；HGFK1的表達與患者的性別、組織類型及吸煙狀態(tài)等臨床特征無明顯關系，HGFK1表達陽性的患者3年PFS期和OS期顯著長于HGFK1表達陰性的患者。

非小細胞肺癌； HGFK1基因； 預后

非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率一直呈上升趨勢，已成為主要的腫瘤死因之一［1-2］，嚴重威脅著人類的生命健康。近70%NSCLC患者在確診時已經(jīng)是晚期，而外科手術切除后3年生存率仍較低［3］。因此探討NSCLC的發(fā)生、發(fā)展機制，提高早期診斷、早期治療率，判斷預后，延長患者的生存期，已成為肺癌研究的關鍵。肝細胞生長因子的第一個環(huán)狀結(jié)構域基因（the kringle 1 domain of hepatocyte growth factor，HGFK1）表達產(chǎn)物于2000年首次被克隆于肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）的α鏈，具體位于肝細胞生長因子的第一個環(huán)狀結(jié)構域［4］。本課題組的前期研究表明，HGFK1不但能夠抑制腫瘤的血管生成，還能夠直接抑制腫瘤細胞的增殖、誘導其凋亡［5-6］。然而目前尚未見HGFK1在肺癌中的表達及意義的研究。本實驗擬通過Western blot法檢測NSCLC組織及正常肺組織內(nèi)HGFK1蛋白的表達，探討其與NSCLC臨床分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預后的關系及相關性，初步探索其在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展中的作用及臨床意義。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院和青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院2003年6月—2007年11月間經(jīng)手術切除的119例NSCLC患者的標本，其中男性73例，女性46例，年齡32~80歲，中位年齡為61歲。所有患者均行肺癌根治術且經(jīng)過組織病理學診斷證實。組織學類型按WHO標準分類：鱗癌57例，腺癌51例，腺鱗癌6例，大細胞肺癌5例。按國際抗癌聯(lián)盟（UICC）標準（1997）進行臨床分期：Ⅰ期35例，Ⅱ期17例，Ⅲ期67例；腫瘤細胞分化程度：高分化23例，中分化44例，低分化52例；病理診斷證實有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者84例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者35例（表1）。生存時間從術后第1天算起，截止期為2010年2月28日。另取外傷手術治療的16例患者的肺正常組織作為對照，其中男性11例，女性5例，年齡17~55歲。

1.2 標本采集 標本離體15 min內(nèi)取材，迅速分成0.5 cm×0.5 cm的小組織塊置于液氮中運送至-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 Western blot檢測 HGFK1兔多克隆抗體和二抗（辣根過氧化酶標記的羊抗兔多克隆抗體），均購自武漢博士德生物工程有限公司；ECL化學發(fā)光檢測試劑盒購自美國Invitrogen公司；PBS緩沖液粉劑購自美國Gibco公司。抽提蛋白樣品使用上海碧云天生物技術有限公司生產(chǎn)的Western及IP細胞裂解液（P0013）裂解組織。樣品經(jīng)SDS-PAGE分離蛋白，濕電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，4 ℃封閉過夜，一抗（1∶1 000稀釋）室溫溫育，洗膜后加入二抗（1∶5 000稀釋）室溫溫育1 h，使用BeyoECL Plus（P0018）等ECL類試劑來檢測蛋白。壓片可以采用專用的壓片暗盒（FFC58/FFC83）進行。洗片時可以使用X光片自動洗片機［5］。

1.4 統(tǒng)計處理 HGFK1表達與肺癌臨床病理特征之間的相關性分析用卡方、Fisher精確檢驗，生存分析用Kaplan-Meier曲線法和Logrank檢驗。所有分析均采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 HGFK1蛋白在NSCLC組織和正常肺組織中的表達 HGFK1蛋白在肺癌組織中陽性表達27例，陽性率為22.7%；正常組織中陽性表達11例，陽性率為68.7%（圖1）；兩者經(jīng)比較，差異有顯著的統(tǒng)計學意義（P<0. 01）。說明HGFK1在肺癌組織中表達下調(diào)（表2）。

2.2 HGFK1蛋白在NSCLC組織表達與臨床病理類型的關系 高分化組（G1）23例中陽性表達11例，陽性率47.8%；中分化組（G2）44例，中陽性表達10例，陽性率22.7%；低分化組（G3）52例中陽性表達6例，陽性率11.5%；3組之間的HGFK1陽性表達率經(jīng)比較，有顯著差異性（P<0.05）。HGFK1蛋白的表達隨癌組織分化程度的降低而降低，說明HGFK1蛋白表達與組織分化程度有關。

2.3 HGFK1蛋白與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關系 淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移組的69例患者肺癌組織中HGFK1表達陽性為8例，陽性率為11.6%；而淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移組的50例患者肺癌組織中HGFK1的表達陽性為19例，陽性率為38.0%。HGFK1蛋白在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組患者的肺癌組織中陽性表達率明顯高于無轉(zhuǎn)移組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

2.4 HGFK1基因表達與無疾病進展生存時間以及總生存期的關系 HGFK1表達陽性組患者的3年無疾病進展生存（progress free survival，PFS）時間以及總生存（overall survival，OS）期均顯著長于HGFK1表達陰性組患者（P值分別為0.002和0.017，圖2）。

表 1 119例NSCLC患者的基本臨床病理資料與HGFK1表達陽性之間的關系Tab. 1 Basic information of 119 patients with NSCLC

表 2 HGFK1在正常肺組織中和NSCLC組織中的表達情況Tab. 2 The expression of HGFK1 in normal and non-small cell lung cancer patients tissues n(%)

3 討 論

HGFK1于2000年首次被克隆于HGF的α鏈，具體位于肝細胞生長因子的第一個環(huán)狀結(jié)構域。HGFK1蛋白包括127~214個氨基酸殘基，相對分子質(zhì)量約為11×103，研究人員發(fā)現(xiàn)其具有強烈抑制牛動脈血管內(nèi)皮細胞的作用［4］，甚至強于血管生成抑制因子（angiostatin）。最近研究發(fā)現(xiàn)，一方面，rAAVHGFK1具有對血管生成的強效抑制作用，可以直接作用于腫瘤血管，從而抑制腫瘤細胞的生長；另一方面，rAAV-HGFK1可在分子水平上針對EGF、VEGF、bFGF以及TGF-beta等多個靶點同時發(fā)揮作用，從而達到阻斷腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的作用［5-6］。而目前現(xiàn)有對HGFK1在肺癌中作用的報道很少，所以研究HGFK1與肺癌臨床病例因素的關系以及其在肺癌中的預后價值有一定必要。有關研究資料表明：肺癌的發(fā)生是由于癌基因激活、抑癌基因失活使細胞增殖失控所造成的［6-8］。p16、p53、c-myc、EGFR和PTEN基因中，有的是重要的抑癌基因，可直接抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡，具有減慢細胞周期的作用。而抑癌基因失活或者癌基因過度表達時，可導致細胞增殖失控、凋亡減少而形成腫瘤或加快腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移［9-10］。盡管如此，NSCLC的發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移的機制尚未能夠完全解釋清楚，進一步研究和NSCLC的發(fā)生發(fā)展相關的新基因是必要的。本研究發(fā)現(xiàn)HGFK1蛋白在肺癌組織中陽性表達27例，陽性率為22.7%；正常組織中陽性表達11例，陽性率為68.7%；兩者比較差異有顯著的統(tǒng)計學意義（P<0.01）。這說明HGFK1在肺癌組織中表達下調(diào)。此外，HGFK1蛋白在23例高分化NSCLC患者的組織（G1）中表達的陽性率為47.8%，中分化（G2）為22.7%；而低分化（G3）為11.5%，3組之間的HGFK1陽性表達率經(jīng)比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），HGFK1蛋白的表達隨癌組織分化程度的降低而降低，說明HGFK1蛋白表達與組織分化程度有關。同時，HGFK1在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組患者的肺癌組織中陽性表達率顯著高于無轉(zhuǎn)移組（P<0.05）；HGFK1蛋白表達陽性組的3年PFS以及OS均顯著長于HGFK1蛋白表達陰性組。這些結(jié)果高度提示HGFK1蛋白和肺癌的發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移相關，其表達與否也顯著影響著NSCLC患者的預后。因此在臨床工作中對NSCLC患者行肺組織活檢測定其HGFK1的表達時，對HGFK1表達陽性者，術中要高度警惕淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移，并徹底清除相關淋巴結(jié)，術后應行放射治療和（或）化學治療，以減少術后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移復發(fā)，延長患者生存時間。這對于NSCLC的早期診斷、預測生物學行為、評估預后及指導臨床治療等方面是一種很有價值的參考指標。

［1］Belani CP, Liao J. Maintenance therapy for non-small cell lung cancer［J］. Lancet, 2010，375(9711): 281-282.

［2］Dahlberg SE, Sandler AB, Brahmer JR, et al. Clinical course of advanced non-small cell lung cancer patients experiencing hypertension during treatment with bevacizumab in combination with carboplatin and paclitaxel on ECOG 4599［J］. J Clin Oncol, 2010, 28(6): 949-954.

［3］Takano T. Treatment of lung cancer［J］. N Engl J Med,2009, 361(25): 2485-2486.

［4］Xin L, Xu R, Zhang Q, et al. Kringle 1 of human hepatocyte growth factor inhibits bovine aortic endothelial cell proliferation stimulated by basic fibroblast growth factor and causes cell apoptosis［J］. Biochem Biophys Res Commun,2000, 277: 186-190.

［5］Shen Z, Yang ZF, Gao Y, et al. The kringle 1 domain of hepatocyte growth factor has antiangiogenic and antitumor cell effects on hepatocellular carcinoma［J］. Cancer Res, 2008,68(2): 404-414.

［6］顧春榮, 郭躍武, 趙暉, 等. 腺相關病毒介導的HGFK1對大鼠肝細胞癌的治療作用研究［J］. 中國癌癥雜志, 2009,19(6): 416-422.

［7］Minegishi Y, Tsukino H, Gemma A, et al. Susceptibility to lung cancer and genetic polyorphisms in the alcohol metabolite related enzymesADH3. ALOM 2 and CyP2E1［J］. Lung Cancer, 2005, 49(supp l2): 193-198.

［8］Takeuchi K, Ito F. EGF receptor in relation to tumor development: molecular basis of responsiveness of cancer cells to EGFR-targeting tyrosine kinase inhibitors［J］. FEBS J,2010, 277(2): 316-326.

［9］Yuan BZ, Defferson AM, Baldw I, et al. DLC-1 operates as a tumor suppressor gene in human non-small cell lung carcinomas［J］. Oncogene, 2004, 23(7): 1405-1411.

［10］Pfeifer GP, Besaratinia A. Mutational spectra of human cancer［J］. Hum Genet, 2009, 125(6): 493-506.

［11］Rossi A, Galetta D, Gridelli C. Biological prognostic and predictive factors in lung cancer［J］. Oncology, 2009,77(Suppl ): 90-96.

Detection of HGFK1 expression and its prognostic significance of in 119 patients with non-small cell lung cancer

ZHOU Xiao-hui,YANG Yi,GAO Zong-li,FAN Li-hong,SHEN Zan,YUE Lu(Department of Pneumology, The 6th People’s Hospital of Shanghai, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200233, China)

SHEN Zan E-mail：shenzanok@yahoo.com

Background and purpose：Our preliminary research shows that HGFK1 can not only inhibit angiogenesis, but significantly inhibit tumor growth and metastasis, while the expression and clinical significance of HGFK1 in lung cancer has not been reported yet. This study aimed to explore the expression state and clinical significance of HGFK1 in the non-small cell lung cancer patients, so as to provide a new prognostic factor and a potential therapeutic target for lung cancer patients.Methods：The subjects were 119 non-small cell lung cancer(NSCLC) cases. Detected the expression of HGFK1 by Western blot in the surgical resection specimens, and further analysed the relationship between the HGFK1 expression and patients’ clinical pathophysiological characteristics and prognosis.Results：The results showed that 22.7% (27/119) of patients with lung cancer expressed HGFK1 protein,while in normal lung tissue the expression of HGFK1 was 68.7% (11/16), which was significantly higher than that of lung cancer tissue. The expression of HGFK1 gene did not associated with patient's age, gender, histological type, and smoking status (P＞0.05). The expression of HGFK1 was significantly correlated with tumor grade and lymph node metastasis. HGFK1 positive rate in tissues of patients with poor pathological grade (G3) was obviously lower (11.5%vs31.3%) compared to that of patients with relatively good pathological grade (G1, G2). While the HGFK1 positive rate in patients with lymph node metastasis tissues were obviously lower than those without lymph node metastasis(11.6%vs47.5%). 3-year progression-free survival (PFS) and overall survival (OS) of the group that HGFK1 was positive expressed were significantly longer than the HGFK1 negative group (Pvalue is 0.002, 0.017, respectively).Conclusion：The expression of HGFK1 gene in normal lung tissues was different from that in NSCLC patients’lung cancer tissues. Furthermore, different cancer tissues of NSCLC patients had different expression status. The patients who had the better pathological grade or without lymph node metastasis had higher HGFK1 positive rate. The expression of HGFK1 had no significant relationship with patient's gender, histological type, smoking status and other clinical features. HGFK1 expression is significantly associated to better 3 years PFS and OS remains.

non-small cell lung cancer; HGFK1 gene; prognosis

R734.2

A

1007-3639(2010)05-0353-05

國家自然科學基金資助項目（編號：30872991）；上海市浦江人才計劃（編號：08PJ14073）。

沈贊 E-mail:shenzanok@yahoo.com

2010-03-26

2010-05-09）