COX-2及VEGF蛋白在大鼠乳腺癌骨移植瘤中的表達(dá)及意義

王日雄 施烯 林學(xué)德 林建華

福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院化療科，△骨腫瘤科，福建 福州350004

COX-2及VEGF蛋白在大鼠乳腺癌骨移植瘤中的表達(dá)及意義

王日雄 施烯 林學(xué)德 林建華

福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院化療科，△骨腫瘤科，福建 福州350004

背景與目的：隨著對(duì)生物學(xué)預(yù)后因子研究的不斷深入，乳腺癌預(yù)后指標(biāo)的聯(lián)合檢測(cè)和應(yīng)用，能更有效、準(zhǔn)確地估計(jì)患者的預(yù)后，并有助于指導(dǎo)乳腺癌的個(gè)體化治療。本研旨在探討究環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）蛋白對(duì)大鼠乳腺癌骨轉(zhuǎn)移發(fā)生、發(fā)展的意義。方法：建立大鼠乳腺癌骨移植模型，觀(guān)察正常組織及建模后腫瘤組織影像學(xué)、組織學(xué)變化，并檢測(cè)COX-2、VEGF蛋白表達(dá)。結(jié)果：隨著建模時(shí)間的延長(zhǎng)，脛骨X線(xiàn)攝片及組織學(xué)顯示腫瘤細(xì)胞向外侵蝕破壞骨皮質(zhì)逐漸加強(qiáng)，COX-2、VEGF蛋白在腫瘤組織中表達(dá)的程度也逐漸增強(qiáng)，在正常組織及建模后第7、14和21天光密度值反映的表達(dá)量分別為916±258、1 694±497、4 304±890和7 111±1 069；930±268、1 944±396、3 226±819和4 746±1 032，兩兩比較差別均有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論：乳腺癌局部高表達(dá)COX-2蛋白可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，并通過(guò)上調(diào)VEGF蛋白水平，促進(jìn)大鼠乳腺骨轉(zhuǎn)移癌的發(fā)生和發(fā)展。

乳腺腫瘤； 骨轉(zhuǎn)移； 環(huán)氧化酶-2； 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子

環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）在多種腫瘤組織中表達(dá)增強(qiáng)，是腫瘤防治的新靶點(diǎn)，主要參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展的過(guò)程，其過(guò)度表達(dá)與腫瘤新生血管的形成有關(guān)［1-2］。另有許多因子參與腫瘤的血管生成，而其中最重要的是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）。本研究通過(guò)對(duì)MRMT-1大鼠乳腺癌細(xì)胞建立的大鼠乳腺癌骨移植模型，對(duì)各時(shí)間段骨移植模型中COX-2、VEGF蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，探討其在大鼠乳腺癌骨轉(zhuǎn)移中發(fā)生、發(fā)展的意義。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和材料 50只雌性SD大鼠，鼠齡2個(gè)月，體質(zhì)量（200±10）g， 購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司；MRMT-1大鼠乳腺癌細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院；COX-2、VEGF抗體及鼠抗因子抗體購(gòu)自Santa Cruz公司。

1.2 大鼠骨移植模型建立 按Medhurst等［3］報(bào)道的方法建立大鼠骨移植模型。50只雌性SD 大鼠，麻醉后，在脛骨上段皮膚切開(kāi) 1 cm小口， 先用 10 mL注射器針頭穿刺打孔，然后換上10 μL注射器進(jìn)入骨髓腔，緩慢注入3 μL含3×103個(gè)MRMT-1大鼠乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞懸液，骨蠟封住針孔，皮膚縫合。所有動(dòng)物都自由取食飲水。

1.3 標(biāo)本檢測(cè) 分別于造模后第7、14和21天X線(xiàn)拍攝脛骨近端，隨后頸椎脫位處死大鼠，取近端脛骨，用4%甲醛溶液固定48 h，15%EDTA（pH=6.5）脫鈣2周，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋切片。

1.4 免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)COX-2和VEGF蛋白表達(dá) 4 μm 石蠟切片，二甲苯常規(guī)脫蠟，乙醇梯度水化，3%H2O2和枸椽酸高壓修復(fù)抗原，非免疫性羊血清室溫封閉30 min，棄上清液，滴加COX-2、VEGF，濕盒內(nèi) 4 ℃冰箱反應(yīng)過(guò)夜，PBS沖洗，滴加二抗，PBS沖洗，DAB 顯色，蘇木素對(duì)比復(fù)染，脫水，二甲苯透明處理，中性樹(shù)膠封固，光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察并拍照。結(jié)果判斷采用計(jì)算機(jī)光密度分析，每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野，用平均光密度值表示COX-2 和VEGF蛋白表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)處理 采用SPSS 10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，LDS檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 骨轉(zhuǎn)移大鼠模型的建立 接種雌性SD大鼠50只，48只發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，另外2只沒(méi)有骨轉(zhuǎn)移的大鼠未見(jiàn)其他部位轉(zhuǎn)移，成瘤率96.0%，成瘤時(shí)間為細(xì)胞移植后第 7～16天，集中在12～14天，在實(shí)驗(yàn)期內(nèi)，大鼠未出現(xiàn)死亡。

2.2 影像學(xué)改變 大鼠脛骨X線(xiàn)片顯示，模型組大鼠注射側(cè)脛骨出現(xiàn)骨破壞的程度與造模時(shí)間成正相關(guān)，時(shí)間越長(zhǎng)，破壞越重。造模第7天X線(xiàn)片僅見(jiàn)注射部位松質(zhì)骨有小的放射性缺損病灶；第14天，X線(xiàn)示松質(zhì)骨放射性病灶增多，同時(shí)骨皮質(zhì)有缺損病灶；到第21天，骨破壞進(jìn)一步加重，骨皮質(zhì)完全缺失（圖1）。

2.3 組織學(xué)觀(guān)察 造模第7天，大鼠脛骨切片顯示，骨髓腔內(nèi)及骨小梁間見(jiàn)大量腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)活躍，骨皮質(zhì)仍完整（除穿刺小缺口外）。造模第14天，骨髓腔內(nèi)充滿(mǎn)了腫瘤細(xì)胞，大部分呈活躍狀態(tài)，骨小梁破壞，骨皮質(zhì)受侵、變薄。造模第21天，骨髓腔完全被腫瘤細(xì)胞所填充，癌細(xì)胞排列密集，核大小不一，染色深，病理性核分裂象異常增多，異型性明顯，骨皮質(zhì)完全破壞、范圍廣泛。

2.4 COX-2及VEGF蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果COX-2正常染色部位在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，VEGF在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜和細(xì)胞外基質(zhì)，陽(yáng)性細(xì)胞為淡黃-棕黃色顆粒著色（圖2，3）。隨著大鼠成瘤時(shí)間的推移，COX-2、VEGF蛋白在腫瘤組織中表達(dá)的程度也逐漸增強(qiáng)，在正常組織及建模后第7、14和21天時(shí)，光密度值反映的表達(dá)量分別為916±258、1 694±497、4 304±890和7 111±1 069；930±268、1 944±396、3 226±819和4 746±1 032，兩兩比較差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01，圖4，5）。

3 討 論

乳腺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移是一個(gè)多因素調(diào)控和多步驟發(fā)展的極其復(fù)雜的過(guò)程。大量研究證明乳腺癌組織中COX-2高表達(dá)［4-5］。乳腺癌中COX-2過(guò)表達(dá)可通過(guò)促進(jìn)新生血管生成、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、抑制凋亡、促進(jìn)播散潛能等，從而促進(jìn)惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展［6］。Hu等［7］研究發(fā)現(xiàn)，COX-2過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)乳腺導(dǎo)管內(nèi)原位癌發(fā)展成為侵襲性乳腺癌。Liu等［8］提供了確切的證據(jù)，COX-2過(guò)表達(dá)足可以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺癌的形成。本研究應(yīng)用放射學(xué)和組織學(xué)的方法對(duì)腫瘤引起的骨破壞程度進(jìn)行了評(píng)估和觀(guān)察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著建模時(shí)間的延長(zhǎng)，脛骨骨質(zhì)破壞程度漸加重，骨轉(zhuǎn)移癌進(jìn)展，COX-2在腫瘤組織中表達(dá)的程度逐漸增強(qiáng)，在正常組織及建模后第7、14和21天，表達(dá)率兩兩比較差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），說(shuō)明COX-2可促進(jìn)大鼠乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生、發(fā)展。

VEGF是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的與實(shí)體瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移關(guān)系最為密切的血管形成調(diào)節(jié)因子，且與COX-2有共表達(dá)的現(xiàn)象［9］。研究證實(shí)VEGF可作為一種可擴(kuò)散的血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性有絲分裂原，由腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生，并以旁分泌形式刺激乳腺癌血管生成，間接促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。體外實(shí)驗(yàn)證明乳腺癌中COX-2過(guò)表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、抑制凋亡，并通過(guò)上調(diào)VEGF水平促進(jìn)新生血管生成，從而促進(jìn)惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展［10］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著骨轉(zhuǎn)移癌的發(fā)生、發(fā)展，COX-2表達(dá)水平增高，VEGF表達(dá)也隨著增高，說(shuō)明COX-2可上調(diào)VEGF水平，從而促進(jìn)新生血管生成，促進(jìn)骨轉(zhuǎn)移癌進(jìn)展。

本研究結(jié)果證明，乳腺癌局部高表達(dá)COX-2可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，并通過(guò)上調(diào)VEGF水平，促進(jìn)腫瘤血管生成，并促進(jìn)大鼠乳腺骨轉(zhuǎn)移癌發(fā)生、發(fā)展。

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Expressions of COX-2 and VEGF on a rat model of bone cancer initiated by MRMT-1 mammary gland carcinoma cells and its significance

WANG Ri-xiong,SHI Xi,LIN Xue-de,LIN Jian-hua(Department of Medical Oncology And Department of Bone Oncology, The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou Fujian 350004, China)

LIN Jian-hua E-mail：riongwang@163.com

Background and purpose：With further research of some prognostic biofactors, especially the study of combined detection and application of several biofactors and its combination with the clinic, the prognosis estimation in breast cancer has been made more efficient and accurate. This information is also helpful to individualized treatments in breast cancer. This study examines the expressions of the vascular endothelial growth factor (VEGF) and cyclooxygenase-2 (COX-2) on a rat model of metastatic bone mammary gland cancer and evaluates the significance of this tumor invasion and metastasis.Methods：The rat model of metastatic bone cancer was initiated by intra–tibial inoculations of the MRMT-1 rat’s mammary gland carcinoma cells in Sprague-Dawley rats. After establishing the model, segments of metastatic bone cancer were extracted to detect COX-2 and VEGF protein expression through the immunohistochemical SP method and the bone structural damage, respectively, and were monitored by radiological analysis and histology.Results：Seven, fourteen and twenty one days after establishing the model, X-ray and histology showed that tumor destroyed the bone more severely. The expressions of COX-2 and VEGF protein were 916±258,1 694±497, 4 304±890, 7 111±1 069, 930±268, 1 944±396, 3 226±819 and 4 746±1 032 (P＜0.05) respectively in the normal tissue 7, 14 and 21 days after establishing the model.Conclusion：A high expression of COX-2 in metastatic bone mammary gland cancer stimulates the proliferation of mammary gland cancer cells. COX-2 advances the level of VEGF to make the tumor angiogenesis and progression.

breast cancer; bone metastatic; cyclooxygenase-2; vascular endothelial growth factor

R737.9

A

1007-3639(2010)05-0348-05

福建省衛(wèi)生廳青年科研基金資助項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：2006-2-11）。

林建華 E-mail:jianhual@126.com

2010-03-04

2010-04-26）