神經母細胞瘤腫瘤細胞球富含表達Nestin細胞的研究

蔡嬌陽 李本尚 劉秋霞 湯靜燕

上海交通大學附屬上海兒童醫(yī)學中心血液腫瘤科，上海 200127

神經母細胞瘤腫瘤細胞球富含表達Nestin細胞的研究

蔡嬌陽 李本尚 劉秋霞 湯靜燕

上海交通大學附屬上海兒童醫(yī)學中心血液腫瘤科，上海 200127

背景與目的：已有研究證實，懸浮生長的腫瘤細胞球具有自我更新和增殖的能力，同時表達干細胞的特征性標記物。本研究旨在通過分離、培養(yǎng)神經母細胞瘤獲得腫瘤細胞球，觀察其在體外的增殖、分化能力，并檢測其表面特征性標志物。方法：取外科手術切除獲得的神經母細胞瘤瘤塊及骨髓轉移患兒的骨髓標本，接種于含生長因子的無血清培養(yǎng)液中，懸浮培養(yǎng)；加入維甲酸（retinoic acid，RA）誘導細胞分化；接種裸鼠，比較腫瘤細胞球與非腫瘤細胞球裸鼠成瘤情況；利用免疫熒光及RT-PCR法比較腫瘤細胞球與非腫瘤細胞球細胞干細胞標志物Nestin表達的差異。結果：神經母細胞瘤細胞在無血清培養(yǎng)液中懸浮生長成腫瘤細胞球，傳代后仍保持很強的自我更新和增殖能力；腫瘤細胞球在RA的誘導下分化，產生具有神經元形態(tài)特征的子代腫瘤細胞；1×104個腫瘤細胞球細胞14 d可形成移植瘤；RT-PCR及免疫熒光檢測證實腫瘤細胞球表達神經干細胞的特異性標志物Nestin。結論：體外培養(yǎng)獲得的神經母細胞瘤腫瘤細胞球中富集腫瘤干細胞；腫瘤細胞球中存在Nestin表達陽性的腫瘤干細胞。

腫瘤干細胞； 神經母細胞瘤； 培養(yǎng)； Nestin

神經母細胞瘤（neuroblastoma，NB）是一種起源于節(jié)后交感神經節(jié)的胚胎性惡性腫瘤，占小兒腫瘤的8%～10%，Ⅲ～Ⅳ期 NB 是預后最差的兒童腫瘤之一，即使達到完全緩解，其中仍有40%～50%以上的患兒會發(fā)生復發(fā)［1］。據(jù)此可以推測在Ⅲ～Ⅳ期的NB患者中，其腫瘤干細胞的含量可能高于其他腫瘤。腫瘤干細胞由于本身基因表達上的差異，其表面標志物的表達可能與其他細胞存在差別。1997年Bonnet和Dick在急性淋巴細胞白血病患者中分離獲得了腫瘤干細胞，首次證實腫瘤中存在腫瘤干細胞［2］。其后研究發(fā)現(xiàn)，實體瘤中也廣泛存在腫瘤干細胞，在對乳腺癌的研究中，Al-Hajj等［3］研究發(fā)現(xiàn)100個有CD44+/CD24-/low/Lineage-表型的乳腺癌細胞即可以成瘤，而其他表型的乳腺癌細胞則無法成瘤［3-4］。近年來，在前列腺癌、卵巢癌和胰腺癌，以及星型細胞瘤和多形性膠質細胞瘤等腦腫瘤中也發(fā)現(xiàn)了腫瘤干細胞的存在［5-8］。Mahller等［9］曾報道，NB腫瘤細胞球中存在CD133、人腺苷三磷酸結合盒轉運體G2（ATP-binding cassette subfamily G member 2，ABCG2）和Nestin為陽性表達的腫瘤干細胞。但目前關于NB腫瘤干細胞的特異性標志物仍未明確。本研究旨在利用無血清培養(yǎng)液懸浮培養(yǎng)獲得腫瘤細胞球（tumor sphere，TS）的方法，分離培養(yǎng)神經母細胞瘤腫瘤細胞球（neuroblastoma tumor sphere，NBTS），同時通過觀察其在體外的增殖和分化；采用免疫熒光及RT-PCR方法，對NBTS細胞的表面特性進行初步的研究，希望能為找到可用于鑒別NB腫瘤干細胞特異性表面標志物的研究提供有效的實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 DMEM/F12培養(yǎng)液、膠原酶和B27購自Gibco公司；人表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、人堿性成纖維生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）購自Invitrogen公司；胰島素、維甲酸（retinoic acid，RA）購自Sigma公司；白蛋白購自Baxter公司；Cy3標記羊抗鼠IgG抗體購自美國 Jackson Immunoresearch Laboratories公司；反轉錄試劑盒購自Promega公司；小鼠抗人Nestin 單克隆抗體購自Abcam公司。BALB/c-nu裸鼠周齡4～6周，體重18～20 g，由中國科學院上海實驗動物中心國家嚙齒類實驗動物種子中心上海分中心提供［SCXK（滬）2007-0005］。

1.2 實驗方法

1.2.1 標本取材和NBTS的原代培養(yǎng) 實驗取材來自外科手術切除神經母細胞瘤瘤塊及骨髓轉移的神經母細胞瘤患兒的骨髓標本。陽性骨髓標本采用Ficoll分離獲得單個核細胞；腫瘤組織標本通過機械剪切成1 mm直徑大小，用0.15%膠原酶消化過夜，用吸管反復吹打成單細胞懸液并重懸于預先配制的DMEM/F12培養(yǎng)液(含2%B27、EGF 20 ng/mL、bFGF 10 ng/mL、0.4%白蛋白、胰島素5 μg/mL)中，置于培養(yǎng)皿中，在37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中懸浮培養(yǎng)。最后采用400目的細胞濾器過濾，分離TS細胞與非TS細胞。

1.2.2 NBTS誘導分化 取懸浮有NBTS的培養(yǎng)液離心后，將細胞接種于不含生長因子，而含5 μmol/L RA的完全培養(yǎng)液中，在相差顯光學微鏡下觀察細胞形態(tài)的變化。

1.2.3 裸鼠成瘤實驗 制備TS與非TS細胞懸液，取樣行錐蟲藍染色并進行活細胞計數(shù)后，調整細胞密度為2×107個/mL備用。將裸鼠隨機分組，TS細胞與非TS細胞各接種4組，每組5只，TS與非TS組接種細胞數(shù)分別為1×104、1×105、1×106和1×107個細胞。在層流超凈工作臺內，取乙醇消毒小鼠右側腋下皮膚；用100 mL微量注射器抽取相應數(shù)量細胞懸液，分別接種于裸鼠腋下皮下，每日觀察腫瘤形成情況。小鼠12周時處死，移植瘤病理切片免疫組織化學檢測結果顯示NSE（+）、Syn（+）和S-100（+），證實為神經母細胞瘤。

1.2.4 RT-PCR檢測TS與非TS干細胞表面標志物表達的差異 分別取TS與非TS細胞各107個抽提總RNA后，在紫外分光光度計波長260 nm處測定其吸光度值并進行定量。之后按照反轉錄試劑盒中的操作步驟，行反轉錄獲得到cDNA；以cDNA為模板，通過干細胞表面標志物（Bmi-1、Oct4、Notch-1、Nanog1、Nanog2、Nestin和ABCG2等）的各引物擴增目的基因（表1），以GAPDH作為內參照，其中Nanog基因設計了2對引物分別進行擴增。擴增的條件為95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s 、58 ℃ 45 s、72 ℃ 1 min，共30個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。行1.5 %瓊脂糖作凝膠電泳鑒定目的基因的表達，經凝膠成像分析系統(tǒng)進行圖像分析。

1.2.5 Nestin的原位免疫熒光檢測 經RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，TS與非TS細胞的表面標志物Nestin的表達存在差異，故進行免疫熒光檢測進一步驗證Nestin在TS與非TS細胞中的表達差異。用400目的濾網區(qū)分出TS及非TS，將細胞用胰酶消化成單個細胞后甩片，可見細胞帖附于載玻片上，隨后進行原位免疫熒光染色。用4%多聚甲醛溶液固定細胞，0.3% TritonX-100破細胞膜，5%牛血清白蛋白封閉，加入一抗小鼠抗人Nestin 單克隆抗體（1∶200稀釋）反應，再加入二抗Cy3標記綿羊抗小鼠IgG反應，最后采用DAPI染核，封固，熒光顯微鏡下觀察細胞并攝片。以PBS代替一抗，為陰性對照。

表 1 RT-PCR擴增各目的基因引物序列Tab. 1 The primer sequence of several stem cell marker genes

2 結 果

2.1 原代NBTS培養(yǎng) 從神經母細胞瘤瘤塊中分離獲得的腫瘤細胞及從骨髓轉移的神經母細胞瘤患兒的骨髓獲得的單個核細胞原代培養(yǎng)5~7 d時，在倒置光學顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，一部分細胞形成懸浮TS，呈圓形或卵球形，大小不一，球體折光性較強（圖1），其余細胞未形成細胞球，部分細胞貼壁生長。1周左右待培養(yǎng)液中懸浮的TS形狀規(guī)則、數(shù)量較多后，取懸浮有TS的培養(yǎng)液離心后棄去半量培養(yǎng)液，重新吹打成單細胞懸液，按1∶2的比例傳代，以后每周傳代1次，至20代左右時TS生長緩慢，部分貼壁分化。

2.2 NBTS的分化 在含5 μmol/L RA的完全培養(yǎng)液中大部分TS在12 h內發(fā)生貼壁生長的變化。TS細胞經RA誘導4～6 d后細胞伸出數(shù)個短的突起而呈多角形，形成假神經節(jié)并有神經微絲伸出（圖2）。這說明NBTS中的腫瘤干細胞在RA的誘導下分化，產生具有神經元形態(tài)特征的子代腫瘤細胞。

2.3 裸鼠成瘤實驗 TS組接種1×104、1×105、1×106和1×107個細胞12~14 d即可形成移植瘤（圖3A），而非TS組1×107個細胞21 d才可成瘤（圖3B），非TS組1×104、1×105、1×106細胞觀察至2個月時仍未見腫瘤形成。瘤體經病理檢查明確為NB。以上結果可以看出，TS中富含腫瘤干細胞，表現(xiàn)出異于其他細胞的強增殖能力。

2.4 RT-PCR及免疫熒光檢測證實NBTS表達Nestin 借鑒正常干細胞的特異性標志物，尋找腫瘤干細胞標記物，選擇Bmi-1、Oct4、Notch-1、Nanog1、Nanog2、Nestin和ABCG2為目的基因進行RT-PCR檢測，結果發(fā)現(xiàn)TS細胞與非TS細胞均表達Oct4和Bmi-1，而僅TS細胞表達Nestin，非TS細胞不表達Nestin（圖4），其余干細胞標志物TS細胞與非TS細胞均不表達。進一步行免疫熒光檢測驗證Nestin在TS與非TS細胞中的表達差異，在熒光顯微鏡下可見TS發(fā)出明亮的紅色熒光，呈細胞質染色模式（圖5），非TS細胞Nestin陰性，表明TS中存在Nestin陽性的腫瘤干細胞。

3 討 論

腫瘤的高復發(fā)率是存在于腫瘤治療中的一個難題，目前研究認為腫瘤的復發(fā)與腫瘤干細胞(cancer stem cell, CSC)存在密切相關［10-12］，CSC對現(xiàn)行的化療和放療相對不敏感從而成為日后復發(fā)的根源。這就要求采取針對CSC的治療措施，而尋找CSC就成為許多腫瘤治療的當務之急和主攻方向。

除血細胞外，正常細胞一般必須貼附在固相表面才能生長，稱為錨著依賴性生長，然而腫瘤細胞在懸浮狀態(tài)下也能生長繁殖，形成細胞球，這些TS可以自我更新和增殖，表達干細胞的特征性標志物［13-14］。Singh等［15］在2003年報道了應用液體無血清培養(yǎng)液從膠質瘤和髓母細胞瘤中分離獲得具有神經干細胞性質的腫瘤細胞球，并證實其為腫瘤干細胞。在本研究中原代培養(yǎng)的NB細胞中部分細胞表現(xiàn)出很強的增殖能力，很快增殖形成TS，這表明在TS中有一小部分細胞為具有顯著的增殖和自我更新能力的CSC；通過比較TS與非TS 兩類細胞的生物學性質，發(fā)現(xiàn)TS細胞具有分化能力及強的裸鼠移植成瘤能力，進一步提示NBTS中富集NB腫瘤干細胞。體外研究證實，順式維甲酸可誘導分化神經母細胞瘤，加速其增殖分化和成熟［16-17］，與本研究結果相符。目前順式維甲酸已經廣泛應用于臨床上NB患兒的治療，對自體造血干細胞移植后體內殘留的神經母細胞瘤的治療起到了良好的作用。

為研究NB腫瘤干細胞的表面特性標志物，本課題組共選擇了7種干細胞共同的特異性標志物為目的基因進行RT-PCR檢測，結果發(fā)現(xiàn)TS細胞表達Nestin，而非TS細胞中不表達Nestin。進一步行免疫熒光染色證實了Nestin在TS與非TS細胞中的表達差異，表明TS中存在Nestin表達陽性的腫瘤干細胞。Nestin是一種中等纖維蛋白，它在哺乳動物神經前體細胞中高表達，已被廣泛用作神經干細胞的標志分子［18］，本研究中TS中的腫瘤干細胞表達Nestin，這與文獻報道一致。此外，Vangipuram等［19］報道認為，表達神經干細胞特異性蛋白標志物CD133+的NB細胞較CD133-的NB細胞，具有更強的對化療藥物的耐藥性，提示CD133可能為NB腫瘤干細胞標志之一。本研究在后繼研究中將針對CD133做進一步分析。

到目前為止，國際上尚未明確特異性的神經母細胞瘤干細胞標志物。如能在本研究基礎上利用現(xiàn)有的TS培養(yǎng)方法及動物模型，采用流式細胞儀、蛋白質組和基因芯片技術，通過比較以上不同表面標記的腫瘤細胞蛋白質表達譜、基因表達譜差異篩選出神經母細胞瘤腫瘤干細胞標志，分離純化后進行其生物性狀的研究，將有助于闡明NB耐藥、復發(fā)以及轉移的關系，對設計實施針對性的靶向治療有著十分重要的意義。

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Research on neuroblastoma tumor spheres enrich cells with cancer stem cell properties which are positive for Nestin

CAI Jiao-yang,LI Ben-shang,LIU Qiu-xia,TANG Jing-yan(Department of Hematology Oncology, Shanghai Children’s Medical Center, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200127, China)

TANG Jing-yan E-mail：yantfk@online.sh.cn

Background and purpose：Spheroids have been shown to derive from stem cells tissues. This study isolated and cultured neuroblastoma tumor spheres, observed their growth pattern and differentiation, and investigated their specific markers in order to help isolate neuroblastoma tumor stem cells.Methods：Dissociated cells from tumors or bone marrow were resuspended in serum-free DMEM/F12 supplemented with insulin, human recombinant epidermal growth factor (EGF), basic fibroblast growth factor (bFGF) and bovine serum albumin.Assessments of spheroid differentiation were made under the condition that 5 μmol/L retinoic acid was given to those with formed spheres. To assess tumorigenicity, tumor sphere cells and non sphere forming tumor cells were injected into the left axilla of 3 to 4 week-old female nude athymic mice. To detect the expression of different stem cell markers in these two types of tumor cells, immunof l uorescence studies and reverse transcription-PCR for Nestin was performed.Results：Tumor sphere cells showed significant capacity for proliferating, self-renewing and differentiation. Tumor sphere cells had a high tumorigenic potential when compared with non sphere forming tumor cells. Tumor spheres were immunopositive for a neural precursor marker, Nestin. RT-PCR analysis also confirmed that the spheres were positive for Nestin.Conclusion：Our data indicated that neuroblastoma tumor spheres were Nestin positive and might have cancer stem cell properties. These spheroids represent a new approach to identify the molecular determinants of neuroblastoma stem cell and aid in developing new therapeutic strategies for this tumor.

cancer stem cell; neuroblastoma; culture; Nestin

R730.264

A

1007-3639(2010)05-0327-05

博士點新教師基金項目（200802481052）；上海市教育委員會科研創(chuàng)新項目（09ZY88）；上海高校選拔培養(yǎng)優(yōu)秀青年教師科研專項基金（jdy08059）；上海市衛(wèi)生局課題（2008026）。

湯靜燕 E-mail:yantfk@online.sh.cn

2010-11-19

2010-04-06）