以硫代葡萄糖苷相對含量優(yōu)選萊菔子炮制工藝研究

任 濤， 呂文海

（山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟南 250355）

以硫代葡萄糖苷相對含量優(yōu)選萊菔子炮制工藝研究

任 濤， 呂文海*

（山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟南 250355）

萊菔子；炮制工藝；硫代葡萄糖苷；HPLC；內(nèi)標法

目的：采用均勻設(shè)計優(yōu)化萊菔子的炮制工藝。方法：為了比較萊菔子清炒前后質(zhì)量變化，選擇烯丙基硫苷作為內(nèi)標，計算用HPLC法測定供試品中硫苷的相對含量，優(yōu)選炒制工藝參數(shù)。結(jié)果：隨著炒制時間延長，萊菔子中硫苷含量會逐漸降低。在炒制溫度200～250℃，炒制時間1～1.5 min時，硫苷含量達到最大，是生品含量的4.2倍。結(jié)論：實驗證明優(yōu)選出的炒萊菔子工藝，有利于硫苷類成分的保存。

萊菔子為中醫(yī)常用消食藥，具“生升熟降”的藥性特點。生品能升能散，長于涌吐風痰；炒后性轉(zhuǎn)沉降，有香氣，可避免生品服后惡心嘔吐的不良反應(yīng)，并長于消食除脹、降氣化痰［1］。目前中醫(yī)臨床中主要應(yīng)用炒萊菔子。

在探討萊菔子炮制機理過程中，認識到其“生升熟降”、“生熟異治”的藥性特點與飲片炮制和服用方法密切相關(guān)。經(jīng)生、炒萊菔子飲片的系統(tǒng)對比分析，在其氣味、揮發(fā)性部位中找到了相應(yīng)的區(qū)別成分［2］。在對水溶性部位的系統(tǒng)對比分析中，證實炒制可抑制萊菔子中芥子酶的活性，防止所含的硫代葡萄糖苷（簡稱硫苷）類成分在煎煮過程中酶解為萊菔子素等，并阻止其進一步生成新的含硫次生產(chǎn)物，從而減弱對消化道運動促進作用的活性（另文發(fā)表）。

參照文獻方法，經(jīng)甲醇提取，沉淀蛋白，酸性氧化鋁柱分離，從萊菔子中得到黃褐色半固體物，經(jīng)HPLC/MS分析，觀察到硫苷特征峰［M—K］-，在MS2質(zhì)譜中所有硫苷都產(chǎn)生m/z 75和m/z 97的碎片峰，分別是［S=C=N—OH］-和［—HSO4］離子。另外還觀察到了和硫苷側(cè)鏈有關(guān)的［R—（C=NOH）—S-離子。定性地證明了所提部位含硫苷類成分。并證實炒萊菔子中硫苷含量遠高于生萊菔子。藥理實驗證明，萊菔子硫苷溶液有顯著的促進小鼠腸推進的作用，可改善因阿托品引起的腸道平滑肌抑制作用，也有一定程度的抑制小鼠胃排空的作用，說明硫苷類成分有可能是反應(yīng)萊菔子生、炒品藥效區(qū)別的成分之一（另文發(fā)表）。萊菔子中的硫苷含量有望成為反映其生、炒品及炮制程度的專屬性指標。在尚未分離到萊菔子中硫苷對照品的情況下，本實驗以烯丙基硫苷（Allyl group glucosinolate）為內(nèi)標物，以HPLC圖譜中萊菔子硫苷與內(nèi)標物峰面積之比為指標，通過均勻設(shè)計，比較了萊菔子不同炮制品中的硫苷相對含量并優(yōu)選了其炮制工藝。

1 實驗材料

1.1 供試飲片 萊菔子，購于鄄城良海中藥飲片有限公司，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院生藥系周鳳琴教授鑒定為十字花科植物蘿卜Raphanus sativus L.的干燥成熟種子。按前期研究確定的凈制工藝凈選，作為生萊菔子備用。

炒萊菔子，取凈萊菔子，用“萊菔子炮制工藝與質(zhì)量標準的規(guī)范化研究”中確定的工藝炒至質(zhì)地鼓起，易脫皮，富油性并有爆裂聲和特有香氣溢出時，取出，晾涼。生、炒品均粉碎成粗粉備用。

1.2 儀器與試劑 高效液相色譜儀 Agilent1100（美國安捷倫科技有限公司），非接觸式紅外測溫儀（AR872D）。

乙腈為色譜純，娃哈哈純凈水，其它試劑均為分析純。烯丙基硫苷（Allyl group glucosinolate）對照品購于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試飲片的制備 在飲片生產(chǎn)中，種子類藥物主用滾筒式炒藥機炮制，對具體品種而言，生產(chǎn)時的投藥量、炒藥機轉(zhuǎn)速為固定值。炒制溫度和時間是需要優(yōu)選的工藝參數(shù)。實驗選用非接觸式紅外測溫儀（AR872D）結(jié)合煤氣爐調(diào)控火力，控制炒萊菔子時的鍋底溫度，通過秒表控制時間。對供試萊菔子樣品進行了均勻試驗設(shè)計。

2.1.1 均勻試驗設(shè)計 在“萊菔子炮制工藝與質(zhì)量標準的規(guī)范化研究”的基礎(chǔ)上，經(jīng)進一步預(yù)試，選用U6（6×3）混和水平均勻設(shè)計表［3］設(shè)計試驗，見表1。

2.1.2 供試樣品的制備 取凈萊菔子6份，每份500 g，按表1的6種工藝組合，投料，炒制，放涼，塑料袋密封，備用。結(jié)果見表2。

2.2 硫苷相對含量測定方法的建立

2.2.1 內(nèi)標物的選擇 參照文獻［4］，對烯丙基硫苷作萊菔子硫苷相對含量測定內(nèi)標物的可行性進行了考察。按2.2.2項和2.2.3項制備濃度為0.379

表1 萊菔子炒制工藝因素水平表

表2 萊菔子樣品炒制結(jié)果

mg/mL烯丙基硫苷對照樣品與萊菔子供試樣品，并在萊菔子供試樣品中加入定量烯丙基硫苷，按2.2.4項色譜條件進樣。結(jié)果表明，烯丙基硫苷與萊菔子中所含硫苷在HPLC譜圖中保留時間接近且能達到基線分離，見圖1～3；用 Agilent1100色譜工作站對其進行紫外全波長掃描，證實二者均在225 nm處有最大吸收。證明烯丙基硫苷可以作為萊菔子中硫苷含量測定的內(nèi)標物。

圖1 烯丙基硫苷對照品HPLC圖譜

圖2 萊菔子中硫苷樣品HPLC圖譜

2.2.2 內(nèi)標物樣品溶液的制備 取烯丙基硫苷對照品，精密稱定。配制成濃度為 0.433、0.379、0.325、0.217、0.108、0.027 1 mg/mL 的內(nèi)標物樣品溶液。

圖3 萊菔子中硫苷加烯丙基硫苷內(nèi)標樣品HPLC圖譜

2.2.3 供試品溶液的制備 取炒萊菔子粉末0.2 g，精密稱定。置50 mL燒瓶中，精密加水25 mL，稱重?；亓魈崛?.0 h，補足失重，抽濾，0.45 μm微孔濾膜過濾。

2.2.4 色譜條件的選擇 色譜柱：Phenomenex-C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.1% 磷酸水溶液（5∶95）；檢測波長：225 nm；參比波長：360 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；進樣量：20 μL。

2.2.5 線性關(guān)系考察

2.2.5.1 內(nèi)標物線性關(guān)系考察 用2.2.2項烯丙基硫苷內(nèi)標物溶液，按2.2.4項下色譜條件測定，以峰面積（Y）對烯丙基硫苷的濃度（X）進行線性回歸，得回歸方程為 Y=18 821X+95.148（r=0.999 7）。實驗表明烯丙基硫苷濃度在0.027 1 mg/mL～0.433 mg/mL范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5.2 樣品與內(nèi)標物峰面積比值與樣品含量線性關(guān)系考察 取炒萊菔子粉末1.6 g，精密稱定。置250 mL燒瓶中，精密加水100 mL，稱重?；亓?.0 h，補足失重，抽濾，分別精密量取濾液 10、8、6、4、2、1 mL置10 mL量瓶中，用水定容至刻度。過0.45 μm微孔濾膜。各供試樣品分別與濃度為0.433 mg/mL的內(nèi)標物溶液按1∶1均勻混合，照2.2.4項色譜條件進樣，計算出樣品硫苷峰面積/內(nèi)標物峰面積的比值，以及供試樣品取樣量（mL）/10的比值，對兩個比值進行線性回歸，得回歸方程為 Y=1.905 6X+0.006 8（r=0.999 9），實驗表明樣品硫苷與內(nèi)標物硫苷的峰面積比與樣品中硫苷含量呈良好的線性關(guān)系。

2.2.6 精密度考察 取炒萊菔子粉末0.2 g，精密稱定。按2.2.3項制備供試品溶液，連續(xù)進樣5次，與濃度為0.433 mg/mL的內(nèi)標物溶液峰面積相比，結(jié)果峰面積比分別為 0.901、0.902、0.906、0.902、0.898，平均值為0.918，RSD為0.29%，表明方法精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性考察 取炒萊菔子粉末0.2 g，精密稱定。按2.2.3項制備供試品溶液，分別于0、0.5、1、2、4、8 h時按2.2.4項下色譜條件進樣，計算萊菔子中硫苷與0.433 mg/mL烯丙基硫苷內(nèi)標物峰面積比分別為：0.944、0.964、0.961、0.959、0.964、0.965，平均值為0.959，RSD為0.79%，表明供試品溶液在制備后8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8 重復(fù)性考察 取5份炒萊菔子粉末0.2 g，精密稱定。按2.2.3項制備供試品溶液，按2.2.4項下色譜條件進樣，計算萊菔子中硫苷與0.433 mg/mL烯丙基硫苷內(nèi)標物峰面積比分別為：0.971、0.924、0.941、0.943、0.913，平均值為 0.939，RSD為2.19%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.3 供試飲片硫苷相對含量測定及工藝優(yōu)選 精密稱取2.1.2項下制備的6份樣品按得率換算成原藥材各0.2 g，按2.2.3項制備樣品及0號生品，按2.2.4項下色譜條件進樣，萊菔子中硫苷與烯丙基硫苷峰面積比的平均值，結(jié)果見表3。

表3 供試飲片中硫苷相對含量結(jié)果（n=3）

實驗數(shù)據(jù)（不含0號）借助Uniform Design version 2.10進行多元回歸分析，得回歸方程：Y=1.188-0.196 9X（1），方程顯著性檢驗：檢驗值Ft=50.48，臨界值 F（0.05，1，4）=7.709，F(xiàn)t＞ F（0.05，1，4），回歸方程顯著。

其中方程項［X（1）］炒制時間進行顯著性檢驗：檢驗值 F（1）=50.48，臨界值 F（0.05，1，4）=7.709，F(xiàn)（1）＞F（0.05，1，4），此方程項顯著；方程項［X（2）］投藥溫度，在200～300℃時對回歸貢獻小，對其進行顯著性檢驗，檢驗值F（2）=5.855×10-2，臨界值 F（0.05，1，3）=10.13，F(xiàn)（2）≤F（0.05，1，3），此方程項不顯著，剔除。

自動試驗條件結(jié)果表明，當投藥時鍋底溫度在200～300℃時，最優(yōu)炒制時間為1 min，預(yù)期指標最大值為0.991 6（±0.113 6）。

分析結(jié)果表明，萊菔子炒制得當，其硫苷相對含量是生品的4.2倍。炒制時間在1.0～3.5 min，投藥時鍋底溫度在200～300℃范圍內(nèi)，溫度對萊菔子炒制工藝影響不顯著，決定炒萊菔子質(zhì)量的主要因素是炒制時間，隨著時間延長，硫苷的含量逐漸降低，結(jié)合實際操作，確定炒萊菔子最佳炒制工藝范圍為：炒制時間1～1.5 min，投藥時鍋底溫度在200～250℃。這與傳統(tǒng)炮制中，萊菔子須急火快炒的經(jīng)驗相一致。

2.4 驗證優(yōu)選工藝 按照優(yōu)選的最佳工藝范圍，做3份驗證性試驗，依2.2項下建立的方法測定，得峰面積比平均值為：0.948，RSD為1.06%，與預(yù)期最大值接近，表明優(yōu)選結(jié)果可信。

3 小結(jié)與討論

3.1 結(jié)合前期工作綜合分析，筆者認為炒萊菔子飲片中硫苷含量的高低是反映其炮制品質(zhì)量的重要專屬性指標。在尚未獲得萊菔子中硫苷對照品的前提下，以烯丙基硫苷為內(nèi)標物，建立了萊菔子飲片中硫苷相對含量的測定方法，經(jīng)方法學(xué)考察，證明其穩(wěn)定可靠，可以反映不同炮制條件下萊菔子飲片中硫苷的相對含量。實驗中以樣品硫苷與內(nèi)標物烯丙基硫苷的峰面積比優(yōu)選炮制工藝，有效地減少了實驗誤差。本文為在沒有專屬對照品條件下，借用內(nèi)標物，對飲片藥效成分相對含量測定在方法學(xué)上進行了有益的探索，為類似研究提供了有益的借鑒。

3.2 通過均勻設(shè)計優(yōu)選出的炮制工藝，其成品性狀與傳統(tǒng)優(yōu)質(zhì)炮制品在外觀性狀上具有高度相似性。其硫苷相對含量是生品的4.2倍，證實炒制得當，可顯著提高萊菔子中硫苷含量。實驗證實，高溫長時間條件下的炒過品硫苷含量大幅下降，表面炭化的樣品中硫苷幾乎損失殆盡，證實了萊菔子傳統(tǒng)炮制中“火候”的科學(xué)性。鑒于萊菔子飲片在品種、含水量、外觀色澤、大小等性狀方面存有一定差異，炮制機械在規(guī)格、性能等方面尚不統(tǒng)一。其優(yōu)選出的炮制工藝參數(shù)，只能是一個范圍。生產(chǎn)中要針對特定設(shè)備，建立科學(xué)的模擬實驗，試驗出適應(yīng)特定設(shè)備并符合所選工藝參數(shù)范圍的具體條件，才能實現(xiàn)優(yōu)選工藝條件的客觀化。這在中藥炮制行業(yè)具有一定的普遍性。生產(chǎn)中對樣品最佳炮制性狀的判斷仍具有較強的經(jīng)驗性。中藥炮制研究中必須正視這一行業(yè)特點，防止炮制工藝研究中的簡單化。

3.3 萊菔子炒制可顯著提高其硫苷相對含量。為進一步建立萊菔子中硫代葡萄糖苷類成分的含量的測定方法，對萊菔子中代表性硫苷成分的分離純化工作正在進行中。

［1］龔千鋒.中藥炮制學(xué)［M］.北京：中國中醫(yī)藥出版社，2005：109.

［2］張 欣，王愛武，宿廷敏，等.萊菔子生制品揮發(fā)性成分GC-MS分析［J］.中成藥，2008，30（1）：96-98.

［3］李 宏.萊菔子現(xiàn)代研究概況［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2001，24（3）：67.

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Processing of Semen raphani based on glucosinolate content

REN Tao， Lü Wen-hai*
（Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355，Shandong，China）

Semen raphani；processing technology；glucosinolates；HPLC；internal standard method

AIM：To optimize the processing parameters of Semen raphani by uniform design.METHODS：In order to compare the change of Semen raphani in quality before and after simple stir-frying，allyl glucosinolate was selected as the internal standard.The relative content of glucosinolate was determined by HPLC and the processing parameters were optimized.RESULTS：The glucosinolate content gradually decreased as the processing time increased，maxima in HPLC peak area appeared at 200-250℃ and in the range of 1-1.5 min and the content of glucosinolate in the processed Semen rahani was 4.2 times as great as that in the non-stir-frying.CONCLUSION：It shows that the optimized processing of Semen raphami is beneficial for the conservation of glucosinolates.

R283

A

1001-1528（2010）07-1159-04

2009-09-10

國家自然科學(xué)基金資助項目（30672665）

任 濤（1984-），男，碩士研究生，從事中藥炮制研究。Tel：13658611056 E-mail：rentao-sd@163.com

*通訊作者：呂文海，教授，研究方向：飲片炮制理論與制備規(guī)范化。E-mail：luwenhaitcm@163.com