NK2受體mRNA在哮喘豚鼠肺組織中表達(dá)的研究

張晗，尚云曉

（中國醫(yī)科大學(xué) 附屬盛京醫(yī)院兒科，沈陽 110004）

支氣管哮喘（簡(jiǎn)稱哮喘）是由多種因素共同參與的氣道慢性炎癥［1］。近年來，氣道的神經(jīng)源性炎癥日益引起關(guān)注。神經(jīng)源性炎癥是指由氣道感覺神經(jīng)末梢釋放的感覺神經(jīng)肽所介導(dǎo)的炎癥。參與哮喘發(fā)病的感覺神經(jīng)肽主要有神經(jīng)激肽A（neuropeptide A，NKA）、P 物質(zhì)（substance P，SP）、神經(jīng)激肽 B（neuropeptide B，NKB）。他們主要通過引起平滑肌收縮，增加血漿外滲，促進(jìn)黏液高分泌及促進(jìn)炎性介質(zhì)釋放等作用參與哮喘的病理生理過程［1］。隨著人們對(duì)哮喘神經(jīng)機(jī)制認(rèn)識(shí)的日益深入，人們發(fā)現(xiàn)NKA、SP、NKB并非直接發(fā)揮作用，而是通過特異的細(xì)胞受體而發(fā)揮生物活性。目前主要有3種感覺神經(jīng)肽受體亞型被鑒定出，即NK1、NK2和NK3受體。其中，NKA主要通過NK2受體而發(fā)揮生物學(xué)活性，同哮喘氣道高反應(yīng)的形成關(guān)系密切，目前被認(rèn)為是哮喘的神經(jīng)機(jī)制中最重要的受體之一。有學(xué)者認(rèn)為速激肽及相關(guān)受體含量增加以及二者的相互作用可能是氣道高反應(yīng)性及慢性炎癥存在的原因［2］。因此，研究速激肽受體意義更大。本實(shí)驗(yàn)采用原位雜交和反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)著重研究NK2受體mRNA在哮喘豚鼠氣管和肺組織中的分布和相對(duì)含量。探討NK2受體與哮喘的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

動(dòng)物模型的制作及分組［3］：將同條件豚鼠按雌雄各半隨機(jī)分為以下各組進(jìn)行研究：（1）哮喘組：按卵蛋白吸入法制作豚鼠哮喘模型。將單只豚鼠置于半封閉的容器中，于1，4，7 d分別超聲霧化吸入1%卵蛋白各3 min使其致敏，然后21 d超聲霧化吸入2%卵蛋白5 min激發(fā)誘喘，直至誘喘成功（豚鼠出現(xiàn)呼吸加快，甚至呼吸困難，聽診可聞及雙肺哮鳴音）24 h后統(tǒng)一取材；（2）正常對(duì)照組：用生理鹽水替代卵蛋白吸入（方法見上）。每組10只豚鼠，種屬、月齡、體質(zhì)量一致。

1.2 研究方法

1.2.1 動(dòng)物標(biāo)本取材：常規(guī)誘喘后24 h內(nèi)統(tǒng)一取材（研究組與對(duì)照組取材時(shí)間一致），取材前以戊巴比妥腹腔注射麻醉。以專用器械（高溫高壓滅菌）取器官及肺組織，置高溫高壓滅菌管中-70℃凍存；另取部分組織用含DEPC的4%多聚甲醛固定，制作石蠟切片。

1.2.2 用原位雜交檢測(cè)氣管肺組織NK2受體mRNA的分布：在組織切片上（石蠟切片），用原位雜交技術(shù)（檢測(cè)方法嚴(yán)格按試劑盒要求），觀察各組NK2受體mRNA在氣管及肺內(nèi)表達(dá)部位及分布。組織經(jīng)固定（4%多聚甲醛，含1/1 000 DEPC），常規(guī)脫水，浸蠟，包埋。涂多聚賴氨酸處理，石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，暴露NK2受體mRNA核酸片段，預(yù)雜交，雜交，依次滴加封閉液、生物素化鼠抗地高辛、SABC、生物素化過氧化物酶，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，酒精脫水，二甲苯透明，封片。在顯微鏡下觀察NK2受體mRNA其表達(dá)的部位，有NK2受體mRNA表達(dá)的細(xì)胞著棕黃色。每只豚鼠肺組織及氣管各選一張切片，隨機(jī)選取正常組9只，哮喘組8只，于鏡下隨機(jī)選取3個(gè)視野（氣管或支氣管周圍），每個(gè)視野隨機(jī)選取一個(gè)氣管黏膜下和平滑肌周圍部位，于400倍條件下照相，利用美國universal imaging porporation圖像分析系統(tǒng)，meta morph軟件測(cè)定其光強(qiáng)度（integrated ODtotal）作為NK2受體mRNA的相對(duì)含量。具體方法如下：任意選取任意一個(gè)到兩個(gè)部位作為標(biāo)準(zhǔn)，用分析儀選取陽性細(xì)胞著色率達(dá)90%時(shí)紅黃藍(lán)達(dá)到的色差百分比作為標(biāo)準(zhǔn)，得到每張切片上的不同部位的NK2受體mRNA的光密度作為相對(duì)含量及陽性細(xì)胞著色相對(duì)百分比。

1.2.3 肺組織NK2受體mRNA的檢測(cè)：用反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)按試劑盒方法檢測(cè)。按總RNA提取試劑盒要求提取肺組織總RNA，取總RNA3μl用于cDNA第一鏈的合成，NK2受體擴(kuò)增片段222 bp上游 5′CCGACCGAGGAA GATAAG 3′；下游 5′TCA ACTGGA TGCCTTTGC 3′；取 cDNA 3 μl用于 PCR擴(kuò)增，在擴(kuò)增體系中加入如下試劑：H2O 16.9μl，10×buffer 2.5 μl，dNTP 3.2 μl，Tag-E 0.2 μl，NK2上游引物0.2μl，NK2下游引物0.2μl；混勻后按下列條件擴(kuò)增：94℃3 min→94℃45 s→53.5℃1 min→72℃1 min→72℃7 min，共35個(gè)循環(huán)。總RNA提取試劑盒由Promega公司提供，TakaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒由TaKaRa公司提供，NK2受體引物由北京奧科生物技術(shù)有限公司合成。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂凝膠電泳后，紫外線等下觀察，照相。用凝膠成像分析系統(tǒng)掃描擴(kuò)增帶，以內(nèi)參照標(biāo)準(zhǔn)化NK2受體值，得到NK2受體的相對(duì)含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)用x±s表示，利用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間差異采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 NK2受體mRNA在哮喘豚鼠氣道內(nèi)的表達(dá)

光鏡下哮喘豚鼠氣管、支氣管及肺組織中均可見到有NK2受體mRNA的表達(dá)明顯，著色呈棕黃色，主要分布于氣管、支氣管的纖毛黏膜下平滑肌周圍；肺實(shí)質(zhì)和間質(zhì)及血管周圍也有少量表達(dá)。正常對(duì)照組在上述部位表達(dá)微弱。見圖1。

2.2 NK2受體mRNA相對(duì)含量

哮喘豚鼠氣管黏膜下和平滑肌周圍NK2受體mRNA相對(duì)含量（9.339±0.817 7）較正常對(duì)照組（2.265±0.74）明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖 2。

哮喘豚鼠肺組織中NK2受體mRNA的表達(dá)的含量（1.046±0.112）較正常對(duì)照組（0.796±0.301）顯著增高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），見圖3，圖4。

3 討論

支氣管哮喘（簡(jiǎn)稱哮喘）是小兒常見的慢性肺部疾病，發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，迄今尚不清楚。據(jù)2006年全球哮喘防治會(huì)議（global initiative for asthma，GINA）認(rèn)為哮喘是一種氣道慢性炎癥疾患，此中許多細(xì)胞和細(xì)胞組分起到重要作用，并伴有氣道反應(yīng)性的增加，呼吸道的神經(jīng)調(diào)節(jié)可能參與氣道炎癥過程和氣道口徑的調(diào)節(jié)，呼吸道炎癥和呼吸道神經(jīng)調(diào)節(jié)的異?？赡芘c哮喘的反復(fù)發(fā)作有關(guān)。炎癥反應(yīng)和神經(jīng)調(diào)節(jié)在不同的病人中或同一個(gè)病人中所起作用不同，或在同一個(gè)病人的不同疾病時(shí)期所起的作用也不同，在慢性呼吸道炎癥和哮喘反復(fù)發(fā)作兩者中包含著免疫和非免疫的機(jī)制。氣道高反應(yīng)性是哮喘的基本特征，氣道慢性炎癥是哮喘的基本病變。隨著對(duì)哮喘的進(jìn)一步研究，哮喘的神經(jīng)機(jī)制日益受到重視。目前認(rèn)為由肺內(nèi)感覺神經(jīng)末稍釋放的神經(jīng)肽所介導(dǎo)的神經(jīng)源性炎癥可能在哮喘發(fā)病機(jī)制中起到重要作用［2，3］。目前研究認(rèn)為，氣道的神經(jīng)調(diào)節(jié)除了經(jīng)典的膽堿能和腎上腺素能神經(jīng)系統(tǒng)外，還存在一種稱為非腎上腺素能，非膽堿能（NANC）神經(jīng)系統(tǒng)。NANC神經(jīng)分為非腎上腺素能、非膽堿能的抑制神經(jīng)（NANCi）和興奮神經(jīng)（NANCe），前者興奮具有舒張平滑肌的作用，其遞質(zhì)是血管活性腸肽（VIP）及一氧化氮（NO）；而后者受到刺激后具有強(qiáng)烈的收縮氣道平滑肌之效應(yīng)?，F(xiàn)認(rèn)為非腎上腺素非堿膽能興奮性神經(jīng)通道是由無髓鞘傳入迷走神經(jīng)纖維構(gòu)成，其遞質(zhì)是感覺神經(jīng)肽。目前認(rèn)為與哮喘關(guān)系較為密切且研究較多的感覺神經(jīng)肽有NKA，NKB，P物質(zhì)，又由于三者有迅速收縮氣道平滑肌之作用，故又稱為速激肽［4］。他們主要通過引起平滑肌收縮，增加血漿外滲，促進(jìn)黏液高分泌及促進(jìn)炎癥介質(zhì)釋放等作用參與哮喘的病理生理過程［5］。研究認(rèn)為NKA是重要的感覺神經(jīng)肽之一，是哮喘患者支氣管肺泡灌洗液（BALF）中主要的速激肽，濃度很高，且在抗原激發(fā)后顯著增高［4］。NKA是在三者中收縮氣道平滑肌的作用最強(qiáng)，這可能同NKA免疫反應(yīng)神經(jīng)在支氣管平滑肌有很廣泛的分布有關(guān)，同時(shí)NKA也有增加氣道微血管滲出及黏液分泌的作用。尚云曉等［6］研究已證實(shí)小兒哮喘發(fā)作期血中NKA含量明顯增高，病情越重增高越明顯，隨哮喘癥狀緩解血中NKA含量下降至正常水平，血中NKA含量的變化與小兒哮喘的發(fā)作及緩解關(guān)系密切。隨著人們對(duì)哮喘神經(jīng)機(jī)制認(rèn)識(shí)的日益加深，人們發(fā)現(xiàn)NKA、SP、NKB并非直接發(fā)揮作用，而是通過特異的細(xì)胞受體而發(fā)揮生物活性。目前主要3種感覺神經(jīng)肽受體亞型被鑒定出，即NK1、NK2和NK3受體。其中，NKA主要通過NK2受體而生物學(xué)活性，目前在哮喘的神經(jīng)機(jī)制中NK2受體被認(rèn)為是最重要的受體之一，同哮喘氣道高反應(yīng)的形成關(guān)系密切［7，8］。NK2受體屬于G蛋白耦聯(lián)受體家族成員，各自由一條7次穿膜的肽鏈構(gòu)成。速激肽同其相應(yīng)受體特異性結(jié)合后，Gp蛋白被激活，隨之由第二信使三磷酸肌醇（IP3），鈣離子-鈣調(diào)蛋白酶途徑導(dǎo)致平滑肌收縮，氣道周圍微血管擴(kuò)張，增加血漿外滲，促進(jìn)黏液高分泌及促進(jìn)炎癥介質(zhì)釋放等。目前認(rèn)為速激肽受體及相關(guān)配體通過上述反應(yīng)參與哮喘的病理生理過程［5］。隨著人們對(duì)哮喘神經(jīng)肽受體的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，NK2受體主要分布于支氣管平滑肌上，其相應(yīng)的配體為NKA，NKA收縮平滑肌的作用最強(qiáng)，因此NK2受體必然參與這種反應(yīng)，NK2受體引起人外周氣道的收縮反應(yīng)最強(qiáng)［9，10］。同時(shí)，Rodger等［11］在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在豚鼠的支氣管及肺實(shí)質(zhì)的細(xì)支氣管，NK2受體也有促進(jìn)黏液分泌的作用。在研究速激肽受體與哮喘類型的研究中發(fā)現(xiàn)，NK2受體主要參與遲發(fā)型哮喘的發(fā)生［12］。我們的實(shí)驗(yàn)采用兩種不同的方法，其研究結(jié)果表明哮喘豚鼠NK2受體mRNA在氣管、支氣管及肺組織中均可見到有表達(dá)，主要分布于氣管、支氣管的纖毛黏膜下平滑肌周圍；肺實(shí)質(zhì)和間質(zhì)及血管周圍也有少量表達(dá)。并且哮喘肺組織中NK2受體mRNA含量卻是較正常對(duì)照組顯著增高，本研究結(jié)果證實(shí)，肺組織中NK2受體mRNA含量變化與卵蛋白致敏后誘發(fā)的豚鼠哮喘關(guān)系極為密切，提示NK2受體參與了哮喘的發(fā)病機(jī)制，同Bait等［7］認(rèn)為哮喘患者NK2受體顯著上調(diào)結(jié)論是一致的。因此速激肽及相關(guān)受體含量增加以及二者的相互作用可能是氣道高反應(yīng)性及慢性炎癥存在的原因。

［1］Ward C，Reid DW，Orsida BE，et al.Inter-relationships between airway inflammation，reticular basement membrane thickening and bronchial hyper-reactivity to methacholine in asthma；a systematic bronchoalveolar lavageand airwaybiopsyanalysis［J］.Clin Exp Allergy，2005，35（12）：1565-1571.

［2］Barnes PJ.Overview of neural mechanism in asthma［J］.Pulm Pharmacol，1995，8（4-5）：151-159.

［3］李淼，尚云曉.哮喘豚鼠氣道內(nèi)NK-1RmRNA表達(dá)及其含量的研究［J］.中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，34（6）：502-504.

［4］Heaney LG，Cross LJ，McGarvey LP，et al.Neurokinin A is the predominant tachykinin in human bronchoalveolar lavagefluid in normal and asthmatic subjects［J］.Thorax，1998，53（5）：357-362.

［5］Van Rensen EL，Hiemstra PS，Rabe KF，et al.Assessment of microvascular leakageviasputuminduction：theroleof substance Pand neurokinin A in patientswith asthma［J］.Am JRespir Crit Care Med，2002，165（9）：1275-1279.

［6］尚云曉，蔡栩栩，韓曉華，等.神經(jīng)激肽A在哮喘患兒血漿含量變化的動(dòng)態(tài)研究［J］.中華兒科雜志，2003，l41（6）：457-459.

［7］Bai TR，Zhou D，Weir T.Substance P （NK1）-and neurokinin A（NK2）-recepter geneexpression in inflammatory airway disease［J］.Am J Physiol，1995，269（3Pt1）：L309-L317.

［8］Rumsey WL，Aharony D，Bialecki RA.Pharmacological characterization of ZD6021：a novel，orally active antagonist of the tachykinin receptors［J］.JPharmacol Exp Ther，2001，298（1）：307-315.

［9］Linden A，Hansson L，Andersson A，et al.Bronchodilation by an inhaled VPAC （2）receptor agonist in patients with stable asthma［J］.Thorax，2003，58（3）：217-221.

［10］Boot JD，de Haas S，Tarasevych S，et al.Effect of an NK1/NK2 Receptor Antagonist on Airway Responses and Inflammation to Allergen in Asthma［J］.Am JRespir Crit Care Med，2007，175（5）：450-457.

［11］Rodger IW，Tousignant C，Young D.Neurokinin receptors subserving plasma extravasation in guinea pig airways［J］.CanJPhysiol Pharmacol，1995，73（7）：927-931.

［12］Schuiling M，Juidhof AB，Zaagsma J.Role of tachykinin NK1 and NK2 receptors in allergen-induced early and late asthmatic reactions，and airway inflammation in conscious，unrestrained guinea pigs［J］.Clin Exp Allergy，1999，29（Suppl 2）：48-52.