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    131I標(biāo)記抗Peroxiredoxin I肺腺癌噬菌體抗體在荷瘤裸鼠體內(nèi)的分布及其對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用

    2010-12-03 08:08:48李淑杰羅弋龐華李少林

    李淑杰,羅弋,龐華,李少林

    (重慶醫(yī)科大學(xué)1.放射醫(yī)學(xué)教研室,分子醫(yī)學(xué)與腫瘤學(xué)研究中心,重慶 400016;2.附屬第一醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科,重慶 400016)

    Prx I是過(guò)氧化物酶(peroxiredoxins,Prxs)的2-Cys亞家族成員,定位于細(xì)胞質(zhì),在肺腺癌細(xì)胞中高表達(dá)[1]。Prx I可減少活性氧自由基的產(chǎn)生,其表達(dá)上調(diào)可增強(qiáng)腫瘤抗氧化能力,是腫瘤抗凋亡和耐藥的重要原因[2],可作為肺癌治療的靶點(diǎn)[3]。

    完全人源化的噬菌體抗體作為第三代基因工程抗體的代表,克服了傳統(tǒng)抗體的異源性、血清清除速率慢[4,5]、療效較低及制備工藝復(fù)雜等弊端,為腫瘤的抗體診斷和治療帶來(lái)新的選擇。本研究以Prx I為靶點(diǎn),利用噬菌體展示技術(shù)制備人源化肺癌抗體,并偶聯(lián)放射性核素,進(jìn)行抗體放免顯像及治療的研究,為進(jìn)一步臨床抗體制劑開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與主要試劑

    抗Prx I肺腺癌噬菌體單鏈抗體為本實(shí)驗(yàn)室自行制備[6];人肺腺癌A549細(xì)胞株購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù);BALB/c裸鼠,SPF級(jí),雄性,體質(zhì)量20~26 g,4~6周齡,購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心;peroxiredoxin I抗原購(gòu)自美國(guó)BPS公司;兔抗人Prx I多抗購(gòu)自英國(guó)ABCAM公司;HRP/羊抗兔IgG二抗購(gòu)自美國(guó)SAB公司;放射性核素Na131I、Na125I均購(gòu)自中國(guó)原子能科學(xué)研究院;SN-684型放射免疫γ計(jì)數(shù)儀為上海核所日環(huán)光電儀器有限公司產(chǎn)品;SPECT顯像儀器采用德國(guó)SIEMENS Symbia T2 SPECT儀。

    1.2 可溶抗體細(xì)胞內(nèi)攝量測(cè)定

    氯胺T法125I標(biāo)記抗體并純化。肺腺癌A549細(xì)胞中加入125I-scFv(1.5×106cpm/1×104cells),37 ℃孵育30 min和120 min,以4℃孵育細(xì)胞為對(duì)照,各做3次。孵育結(jié)束后分別PBS液洗滌細(xì)胞3次,再以冰預(yù)冷甘氨酸緩沖液(0.1 mol/L glycine-HCl,2 mol/L urea,pH2.2)洗3 次,每次2min,以洗脫細(xì)胞表面結(jié)合的125I-scFv,收集洗脫液。再以2%SDS溶解細(xì)胞,收集溶胞產(chǎn)物。分別用γ計(jì)數(shù)儀測(cè)洗脫液和溶胞產(chǎn)物放射性計(jì)數(shù)。

    1.3 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制檢測(cè)

    將 A549細(xì)胞(3×104/ml)接種 96孔板(100 μl/well),設(shè)立空白對(duì)照組,各組3個(gè)復(fù)孔。72 h后行MTT法檢測(cè)(490 nm)細(xì)胞增殖情況。

    將 A549細(xì)胞(1×106/ml)接種于培養(yǎng)瓶,培養(yǎng)液體積1ml。加入1ml scFv(0.5 μmol/L)。72 h 后消化細(xì)胞,用Annexin V-FITC/PI雙染法上流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。

    1.4 A549細(xì)胞Prx I蛋白表達(dá)

    將A549細(xì)胞(5×106/ml)接種培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。加入1 ml scFv(0.5 μmol/L)。設(shè)空白對(duì)照(以PBS替代scFv抗體)。72 h后Western blot檢測(cè)Prx I蛋白表達(dá)水平,以兔抗人Prx I多抗為一抗,HRP/羊抗兔IgG為二抗。計(jì)算Prx I蛋白條帶與β-actin內(nèi)參條帶光密度比值,以其表示Prx I蛋白表達(dá)的相對(duì)強(qiáng)度。

    1.5 scFv的131I標(biāo)記及鑒定

    氯胺T法標(biāo)記抗體后將標(biāo)記反應(yīng)液注入1×15 cm Sephadex G200柱,用0.01 mol/L PBS洗脫純化。三氯醋酸沉淀法計(jì)算標(biāo)記率。以正丁醇和乙酸混合液為展開(kāi)劑,紙層析法測(cè)定標(biāo)記物的放射性化學(xué)純度和比活度。

    1.6 荷瘤裸鼠模型的建立

    對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期肺腺癌A549細(xì)胞以5×106cell/200 μl濃度接種于裸鼠右前肢后方皮下。觀察生長(zhǎng)情況,待腫瘤直徑長(zhǎng)至0.7~1.0 cm時(shí)用于下一步實(shí)驗(yàn)。

    1.7 生物分布測(cè)定

    每只荷瘤裸鼠尾靜脈注射131I-scFv200 μl(約18.5 MBq),共注射12只,并隨機(jī)分為4組。分別于注射后12 h、24 h、48 h和72 h處死各組裸鼠,剝離腫瘤組織及主要器官,稱質(zhì)量,用γ計(jì)數(shù)儀測(cè)定放射性計(jì)數(shù),計(jì)算每克組織百分注射劑量率(%ID/g)。

    1.8 放射免疫顯像

    取3只荷瘤裸鼠,注射131I-scFv前3 d以1%KI封閉甲狀腺。每只裸鼠分別于尾靜脈注射200 μl新鮮配制的131I-scFv(約18.5 MBq)。將裸鼠固定后在注射核素標(biāo)記抗體后12 h、24 h、48 h和72 h分別進(jìn)行SPECT顯像。儀器采用高分辨準(zhǔn)直器,距陣256×256,能峰364 keV,計(jì)數(shù)25 K-30 K,2倍放大。以腫瘤部位對(duì)側(cè)組織為感興趣區(qū)(region of interest,ROI),測(cè)定靶器官/周?chē)M織(T/NT)值。

    1.9 荷瘤裸鼠分組治療觀察

    將15只荷瘤裸鼠隨機(jī)分為3組:生理鹽水對(duì)照組(注射生理鹽水0.1 ml)、131I-IgG治療組(注射131IIgG約20 MBq)和131I-scFv治療組(注射131I-scFv約20 MBq),1次/2 d,共14次。游標(biāo)卡尺每3 d測(cè)量一次腫瘤最大直徑(a)和最大垂直直徑(b)。4周后處死裸鼠,剝離腫瘤組織、稱重,計(jì)算抑瘤率IR=(Vo-Vn)/Vo×100%,Vo為對(duì)照組腫瘤體積,Vn為治療組腫瘤體積。4周后處死各組裸鼠,剝離腫瘤組織,用10%甲醛固定,石蠟包埋后作病理切片,HE染色后觀察病理學(xué)改變。

    1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    2 結(jié)果

    2.1 A549細(xì)胞內(nèi)攝可溶抗體

    溶胞產(chǎn)物的放射性計(jì)數(shù)評(píng)估細(xì)胞內(nèi)攝125I-scFv量,甘氨酸洗脫液和溶胞產(chǎn)物總和的放射性計(jì)數(shù)評(píng)估細(xì)胞結(jié)合125I-scFv的總量。經(jīng)γ計(jì)數(shù)儀測(cè)定,120 min時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞結(jié)合抗體的總量及內(nèi)攝量均為30 min時(shí)間點(diǎn)的2倍。內(nèi)攝抗體量占細(xì)胞總結(jié)合抗體量的比例在2個(gè)時(shí)間點(diǎn)保持相對(duì)穩(wěn)定,分別為40.3%(30 min)和 44.7%(120 min)。

    2.2 MTT法及流式細(xì)胞術(shù)評(píng)價(jià)細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡情況

    單鏈抗體scFv作用于A549細(xì)胞72 h后進(jìn)行MTT分析??梢?jiàn)scFv對(duì)細(xì)胞有劑量依賴的抗增殖作用(圖1)。AnnexinV-FITC/PI法流式細(xì)胞儀檢測(cè)A549細(xì)胞凋亡,scFv干預(yù)組細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組明顯增加(圖2)。

    2.3 Prx I蛋白表達(dá)水平測(cè)定

    可溶單鏈抗體scFv干預(yù)A549細(xì)胞72 h后,提取總蛋白,進(jìn)行Western blot檢測(cè)??梢?jiàn)樣品組Prx I蛋白表達(dá)水平低于空白對(duì)照組(P<0.05)(圖3)。結(jié)果證實(shí)可溶抗體scFv干預(yù)后細(xì)胞Prx I蛋白表達(dá)受到抑制。

    2.4 131I-scFv的標(biāo)記結(jié)果

    三氯乙酸沉淀法測(cè)得131I-scFv標(biāo)記率為(83.2±6.5)%。131I-scFv的放射化學(xué)純度為(95.6±3.7)%,比活度為(2.8±0.2)MBq/μg。

    2.5 131I-scFv在荷瘤裸鼠體內(nèi)的分布

    測(cè)定12只荷瘤裸鼠腫瘤、血液、肝、腎、脾、腸、肌肉等器官組織的放射性。在48 h腫瘤攝取131I-scFv抗體量達(dá)(3.78±0.65)%ID/g。此時(shí)瘤/血放射性比值和瘤/肌肉放射性比值均達(dá)最大值,分別為4.06±0.13 和5.17±0.97。

    2.6 放射免疫顯像

    結(jié)果顯示,腫瘤部位有放射性核素濃聚,可見(jiàn)腫瘤清晰顯像。勾畫(huà)ROI,計(jì)算T/NT值。12h、24 h、48 h 和 72 h 分別為1.26±0.15、2.18±0.16、3.73±0.20 和2.85±0.18。48 h顯像的T/NT值明顯高于其他時(shí)間點(diǎn)(F均>86,P 均<0.01),且腫瘤顯示最清晰(圖4)。

    2.7 各組裸鼠治療效果比較

    治療4周后131I-scFv組腫瘤質(zhì)量[(2.37±0.58)g]、體積[(1.36±0.33)cm3]較其他2組有明顯降低,抑瘤率56.8%,抑瘤作用明顯,而其他2組間無(wú)明顯差異。將各組腫瘤切片后HE染色鏡下觀察。與空白對(duì)照組比較,131I-scFv治療組腫瘤切片可見(jiàn)大片腫瘤細(xì)胞壞死,核碎裂、核溶解明顯,細(xì)胞間質(zhì)呈紅染無(wú)結(jié)構(gòu)物質(zhì)(圖5)。

    3 討論

    噬菌體抗體以其制備簡(jiǎn)便、可以規(guī)?;a(chǎn)及完全人源化的優(yōu)勢(shì),在臨床腫瘤治療中成為新的選擇和補(bǔ)充[7,8]。經(jīng)檢測(cè),本實(shí)驗(yàn)室前期制備的抗Prx I肺腺癌噬菌體單鏈抗體與高表達(dá)Prx I的肺腺癌A549細(xì)胞有較強(qiáng)的特異性結(jié)合活性,為抗體的體內(nèi)分布及抑瘤作用研究提供了保證。

    因?yàn)榭贵w庫(kù)的篩選是在體外以腫瘤細(xì)胞及純化的Prx I作為靶抗原進(jìn)行的,因此有必要在體內(nèi)對(duì)抗體結(jié)合高表達(dá)Prx I肺腺癌組織的能力進(jìn)行檢測(cè)。本研究觀察到抗體在腫瘤部位得到有效濃聚,而腸、肝及腎臟對(duì)抗體的攝取也較高。在注射后12 h,瘤/血比值和瘤/肌肉比值分別是0.77和1.65,并且在第48 h均達(dá)到最大值,分別為4.06和5.17。SPECT也提示相同的結(jié)果,注射后12 h時(shí)胃腸和腎臟是主要的非特異性攝取器官,但隨著注射后時(shí)間的延長(zhǎng),腫瘤部位顯像越來(lái)越清晰,而到第48 h時(shí)腫瘤顯像最為清晰,非特異性攝取明顯減少。并且由于代謝的原因,此時(shí)腫瘤顯像較第72 h時(shí)更為清晰。

    抗體的治療作用研究是接下來(lái)需要考察的內(nèi)容。已有研究表明,噬菌體單鏈抗體與細(xì)胞表面分子的結(jié)合內(nèi)攝可介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞重要的生理進(jìn)程,具有內(nèi)在的抗增殖活性[9]。我們的前期研究中,采用肺腺癌患者癌旁淋巴結(jié)組織作為抗體基因來(lái)源,制備得到了特異性較好的抗Prx I肺腺癌相關(guān)噬菌體抗體。在本研究的體外抑制肺腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)中,證實(shí)了單鏈抗體與A549細(xì)胞結(jié)合后能被有效內(nèi)攝進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),并介導(dǎo)了劑量相關(guān)的抗腫瘤細(xì)胞增殖效應(yīng),觀察到靶細(xì)胞凋亡的增加,以及細(xì)胞內(nèi)Prx I蛋白表達(dá)量的下降?;谝陨辖Y(jié)果,可以推測(cè)抗體的抗增殖作用是因?yàn)閮?nèi)攝的抗體限制了細(xì)胞受體數(shù)量,并且在與Prx I表位結(jié)合后,降低了腫瘤細(xì)胞的抗氧化能力,從而促進(jìn)了細(xì)胞的增殖抑制和凋亡。關(guān)于該抗體抑制肺腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制,需要進(jìn)一步的深入研究。在荷瘤裸鼠模型進(jìn)行的核素標(biāo)記抗體放免治療實(shí)驗(yàn)中,通過(guò)靜脈給藥,也同樣觀察到腫瘤體積和質(zhì)量的減小,證實(shí)了131I標(biāo)記單鏈抗體用于放免治療的可行性和有效性。

    噬菌體單鏈抗體作為最具應(yīng)用潛力的治療性抗體,在腫瘤抗體治療中揮發(fā)日益重要的作用。本研究利用以肺腺癌細(xì)胞及其高表達(dá)的Prx I作為治療靶點(diǎn)的噬菌體抗體進(jìn)行抗體體內(nèi)分布及抑瘤作用研究,證實(shí)抗體具有良好的藥代動(dòng)力學(xué)特性,與131I標(biāo)記后能有效抑制肺腺癌腫瘤的生長(zhǎng),具有進(jìn)一步開(kāi)發(fā)制備腫瘤放免顯像及治療藥物的應(yīng)用潛力。

    [1]Chang JW,Lee SH,Jeong JY,et al.Peroxiredoxin I is an autoimmunogenic tumor antigen in non-small cell lung cancer[J].FEBS Lett,2005,579(13):2873-2877.

    [2]Chang JW,Jeon HB,Lee JH,et al.Augmented expression of Peroxiredoxin I in lung cancer[J].Biochem Biophy Res Commun,2001,289(2):507-512.

    [3]Kim JH,Bogner PN,Baek SH,et al.Up-regulation of peroxiredoxin1in lung cancer and its implication as a prognostic and therapeutic target[J].Clin Cancer Res,2008,14(8):2326-2333.

    [4]Xiao J,Horst S,Hinkle G,et al.Pharmacokinetics and clinical evaluation of125I-radiolabeled humanized CC49 monoclonal antibody(HuCC49deltaC(H)2)in recurrent and metastatic colorectal cancer patients[J].Cancer Biother Radiopharm,2005,20(1):16-26.

    [5]Weiner LM.Fully human therapeutic monoclonal antibodies [J].J Immunother,2006,29(1):1-9.

    [6]羅弋,龐華,李少林,等.人源抗Peroxiredoxin I肺腺癌噬菌體抗體的制備及鑒定[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2010,30(1):30-34.

    [7]Yamashita T,Utoguchi N,Suzuki R,et al.Development of anti-tumor blood vessel antibodies by phage display method [J].Yakugaku Zasshi,2010,130(4):479-485.

    [8]Majidi J,Barar J,Baradaran B,et al.Target therapy of cancer:implementation of monoclonal antibodies and nanobodies [J].Hum Antibodies,2009,18(3):81-100.

    [9]Liu B,Conrad F,Cooperberg MR,et al.Mapping tumor epitope space by direct selection of single-chain Fv antibody libraries on prostate cancer cells[J].Cancer Res,2004,64(2):704-710.

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