胰高血糖素受體siRNA對(duì)糖尿病模型小鼠的降糖作用研究

周潔，彭金良，徐宇虹#（.上海交通大學(xué)藥學(xué)院分子藥劑學(xué)實(shí)驗(yàn)室，上海市 200240；2.上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，上海市 200240）

對(duì)于2型糖尿病病癥，胰高血糖素受體（GCGR）與胰高血糖素之間的相互作用對(duì)于血糖調(diào)節(jié)具有重要意義。一方面，胰高血糖素可促進(jìn)糖異生和糖原分解；另一方面，胰高血糖素可間接影響胰島素分泌情況。因此通過抑制GCGR發(fā)揮作用可以緩解高血糖癥狀。有研究[1]發(fā)現(xiàn)GCGR的基因敲除后模型小鼠中血糖濃度明顯降低，并且小鼠的糖耐量得到了很好的提高，這一發(fā)現(xiàn)也證實(shí)了GCGR在降糖中的重要地位。

為了達(dá)到降糖的目的，需要有效的手段以抑制肝臟中GCGR的表達(dá)。近年來小分子藥物GCGR拮抗藥被報(bào)道具有很好的降糖穩(wěn)定作用[2]；GCGR的反義抑制核苷酸也被證實(shí)能夠有效地改善糖尿病模型小鼠的高血糖癥狀[3]。而近年來，siRNA類藥被認(rèn)為是一種更有效的抑制特定基因表達(dá)的藥物，具有極大的應(yīng)用前景[4]?；诖?，在本研究中，筆者設(shè)計(jì)和研發(fā)了針對(duì)糖尿病小鼠模型GCGR的siRNA，考察了經(jīng)高壓快速靜脈注射系統(tǒng)給藥后，siRNA類藥在緩解模型小鼠血糖癥狀中的作用情況。

1 材料

Milli-Q型純水機(jī)（美國Millipore公司）；BS210S電子天平（德國Sartorius公司）；UV-21.2PC可見-紫外分光光度計(jì)（尤尼柯上海儀器有限公司）；pHS-2S型數(shù)顯酸度計(jì)（上海天達(dá)儀器有限公司）；Centrifuge 5415R離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；BCM-100生物潔凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；DK-S24電熱恒溫水槽（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

四氧嘧啶（Alloxan monohydrate，美國Sigma公司，色譜純）；葡萄糖測(cè)定試劑盒（上海榮盛生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20030101）；靶向GCGR的3條長度為21 bp的siRNA雙鏈序列（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，色譜純化單鏈凍干粉，純度：＞97%）；焦磷酸二乙酯（DEPC）處理除去RNA酶的磷酸鹽緩沖溶液（PBS，自制）。

健康昆明鼠，♂，6周齡，體質(zhì)量30 g左右，由上海斯萊克試驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司提供（許可證號(hào)：SCXK（滬）-2007-0005）。于上海交通大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心20℃明暗交替環(huán)境中適應(yīng)性預(yù)培養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 siRNA設(shè)計(jì)合成

設(shè)計(jì)針對(duì)小鼠GCGR的siRNA。根據(jù)GCGR的refseq序列NM_008101，根據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原理，使用siRNA設(shè)計(jì)軟件[5]，設(shè)計(jì)格式為AA19NTT、長度為21 bp的siRNA。挑選3條分別靶向于GCGR基因不同位點(diǎn)的siRNA，結(jié)果如下：GCGR siRNA-1靶序列AAAGCTCTTCAGGAGGAAAGGTT（GCGR基因1451～1473 bp處），正義鏈5′-AGCUCUUCAGGAGGAAAGGUU，反義鏈3′-UUUCGAGAAGUCCUCCUUUCC；siRNA-2靶序列AAAGTGCAGCACCGCCTAGTGTT（455～477 bp處），正義鏈5′-AGUGCAGCACCGCCUAGUGUU，反義鏈3′-UUUCACGUCGUGGCGGAUCAC；siRNA-3靶序列AACTACATCCATGGGAACCTGTT（707～729 bp處），正義鏈 5′-CUACAUCCAUGGGAACCUGUU 反義鏈 3′-UUGAUGUAGGUACCCUUGGAC。對(duì)照組非靶向性siRNA正義鏈5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT，反義鏈3′-TTAAGAGGCUUGCACAGUGCA。siRNA的合成均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司完成。

將合成得到的4條siRNA序列用DEPC處理過的pH7.4、平衡后的PBS溶解，濃度為1 nmol·mL－1，備用。整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作過程在無菌操凈臺(tái)上進(jìn)行，移液槍槍頭耗材等均使用DEPC處理過。

本文中數(shù)據(jù)處理以及作圖采用Microsoft Office Excel 2003，組內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算采用Excel標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算函數(shù)Stdev。

2.2 糖尿病模型小鼠以及血糖檢測(cè)方法的建立

2.2.1 糖尿病模型小鼠建立及其健康狀況監(jiān)測(cè)。本研究中采用2%（W%）四氧嘧啶/PBS誘導(dǎo)建立小鼠糖尿病模型：取小鼠20只，適應(yīng)飼養(yǎng)環(huán)境1周并測(cè)正常小鼠空腹4 h后的體質(zhì)量以及血糖含量；小鼠禁食不禁水12 h后，配制新鮮的四氧嘧啶誘導(dǎo)劑溶液，給藥方式為一次性腹腔注射（ip），劑量為200 mg·kg－1（體質(zhì)量）。注射完畢后為小鼠補(bǔ)充飲水以及食物，并且更換墊料。注射誘導(dǎo)劑72 h后，測(cè)量空腹4 h以后的小鼠體質(zhì)量以及血糖含量，檢測(cè)建模成功率并且進(jìn)行分組。20只小鼠誘導(dǎo)前血糖含量均值為（7.1±3.0）mmol·L－1，誘導(dǎo)后死亡2只，血糖含量大于15 mmol·L－1的小鼠共12只，血糖含量均值（34.6±3.9）mmol·L－1，誘導(dǎo)建模成功率為60%。

將12只建模成功后的小鼠分為4組，每組3只，各組血糖含量平均值分別為A組（38.4±3.3）mmol·L－1、B組（29.2±4.6）mmol·L－1、C 組（34.8±3.8）mmol·L－1、D 組（36.1±2.1）mmol·L－1。

建模后16 d內(nèi)，檢測(cè)各組小鼠體質(zhì)量情況以了解其健康狀態(tài)，結(jié)果見表1。

表1 建模后不同時(shí)間各組小鼠體質(zhì)量變化數(shù)據(jù)（g，，n＝3）Tab 1 Changes of body weight of mice after modeling（g，，n＝3）

表1 建模后不同時(shí)間各組小鼠體質(zhì)量變化數(shù)據(jù)（g，，n＝3）Tab 1 Changes of body weight of mice after modeling（g，，n＝3）

1631.2±2.636.4±2.236.9±4.031.5±3.4組別A組B組C組D組時(shí)間/d 033.9±0.533.6±3.431.5±0.732.6±1.5124835.4±4.333.9±1.934.8±3.831.2±1.932.4±1.934.1±3.031.8±2.530.1±1.631.1±0.833.4±2.932.3±3.730.5±1.131.7±1.835.9±2.734.8±3.732.3±0.61230.5±1.936.5±2.237.9±4.529.5±0.4

由表1可知，誘導(dǎo)后糖尿病模型小鼠體質(zhì)量較為穩(wěn)定，健康狀態(tài)良好。

2.2.2 血糖含量檢測(cè)方法的建立。小鼠禁食不禁水4 h后，盡量保持小鼠情緒平靜，迅速用毛細(xì)玻璃管于小鼠眼底取血100 μL左右（3～4滴血），置于0.5 mL離心管中。血液樣本于4℃冰箱中冷藏放置至離心管底部出現(xiàn)血液凝結(jié)后，立即于4℃離心（3000 r·min－1，5 min），取上層血清作葡萄糖含量檢測(cè)。

將葡萄糖檢測(cè)試劑盒中的R1、R2工作液等比例混合作為測(cè)試液。取血清樣本4μL加入1 mL的測(cè)試液中，充分混勻，立即置于37℃電熱恒溫水槽中放置15 min，使之顯色。在紫外波長505 nm處，以空白測(cè)試液加蒸餾水作對(duì)照調(diào)零，讀取樣本管的吸光度值。同時(shí)，制備5～30 mmol·L－1梯度濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，制作吸光度值-葡萄糖濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線從而讀取樣本的葡萄糖濃度。

本實(shí)驗(yàn)條件下葡萄糖系列濃度回歸方程為葡萄糖濃度（mmol·L－1）＝59.265×吸光度值－2.250（R2＝0.9962），按照此回歸方程可測(cè)算血液中的葡萄糖濃度。

2.3 小鼠給予siRNA后血糖含量及糖耐量實(shí)驗(yàn)

2.3.1 給藥。造模成功后，模型小鼠正常飼養(yǎng)第2天，按照“2.2.1”項(xiàng)下分組情況分別給藥：A組siRNA-1，B組siRNA-2，C組siRNA-3，D組非靶向性siRNA。

取“2.1”項(xiàng)中濃度為1 nmol·mL－1的4種siRNA溶液，按照溶液體積為小鼠體質(zhì)量的10%進(jìn)行給藥，例如，1只體質(zhì)量為30 g的小鼠給藥劑量約為3 nmol siRNA物；給藥劑量參考文獻(xiàn)[6]，進(jìn)行小鼠肝靶向體內(nèi)靜脈給藥實(shí)驗(yàn)。給藥方式采用尾靜脈高壓快速推注法一次性給藥；給藥完畢后密切觀察小鼠，及時(shí)補(bǔ)充水和飼料。

2.3.2 給藥后血糖含量-時(shí)間變化情況。分別于給藥后第1、2、4、8 d時(shí)按照“2.2.2”項(xiàng)下方法測(cè)量4組中各小鼠血糖含量，得到不同siRNA序列給藥后小鼠血糖含量變化曲線，見圖1。

圖1 給藥后不同時(shí)間各組小鼠血糖含量變化Fig 1 Level of blood glucose in diabetic rats at different time points after treatment

由圖1可見，A組給藥后第1天血糖含量（5.4±1.5）mmol·L－1，與給藥前比較降低了86.0%，此后的幾天內(nèi)血糖含量有所回升，但第8天血糖含量依然低于給藥前血糖，為（11.7±3.5）mmol·L－1，與給藥前比較降低了69.4%；B組給藥后第1天血糖含量（17.1±1.4）mmol·L－1，與給藥前比較降低了41.4%，此后的幾天血糖含量回升；C組給藥后第1天血糖含量（27.1±7.8）mmol·L－1，與給藥前比較降低了22.2%，此后的幾天血糖回升；D組給藥后第1天血糖含量（37.8±4.2）mmol·L－1，與給藥前比較升高了4.7%，此后的幾天血糖逐漸升高，第8天時(shí)與給藥前比較升高了32%。

2.3.3 糖耐量試驗(yàn)。在siRNA給藥后第2天，所有4組小鼠禁食4 h后取血測(cè)血糖含量，并定為零時(shí)刻數(shù)據(jù)，ip葡萄糖，劑量為2 g·kg－1。于給糖后30、60、90、120 min時(shí)間點(diǎn)分別取血測(cè)量4組小鼠血糖含量，得到血糖含量-時(shí)間曲線，見圖2。

圖2 腹腔注射葡萄糖后不同時(shí)間點(diǎn)各組小鼠血糖含量變化Fig 2 Level of blood glucose in diabetic rats at different time points after intraperitoneally injected with glucose

計(jì)算得出A、B、C、D 4組血糖含量-時(shí)間曲線下面積（AUC）分別為964.5、3216.1、2606.9、4173.9 min·mmol·L－1。此值可反映小鼠對(duì)葡萄糖的利用程度，AUC的值越小，證明其越能有效地利用葡萄糖。其中A、B、C組的AUC值分別為D組的23.11%、77.1%、62.5%。

3 討論

通過對(duì)給藥后模型小鼠血糖含量的監(jiān)測(cè)，證實(shí)siRNA對(duì)模型小鼠具有一定的緩解高血糖癥狀的效果。其中，siRNA-1的降糖效果最為顯著，給藥后第1天血糖含量與給藥前比較降低達(dá)86.0%，siRNA-2和siRNA-3也有不同程度的降糖作用，并以在給藥后第1天作用最明顯，第3天后血糖含量有所回升，這可能與siRNA在小鼠體內(nèi)發(fā)生降解有關(guān)。此外，siRNA-1在給藥后8 d內(nèi)血糖并未回升到給藥前水平，這可能是siRNA-1給藥后具有改善小鼠機(jī)體功能的作用，引發(fā)了小鼠體內(nèi)自主降糖的生理過程所致。siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3對(duì)模型小鼠的不同降糖作用說明，針對(duì)GCGR基因的不同位點(diǎn)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后可能產(chǎn)生各異的作用。

在糖耐量實(shí)驗(yàn)中，由AUC結(jié)果可知，siRNA給藥后與對(duì)照組比較能更好地改善小鼠利用葡萄糖情況，說明siRNA不僅能夠有效地緩解高血糖癥狀，還能夠改善糖尿病小鼠對(duì)于葡萄糖的生物利用率，該過程機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。

[1]Gelling RW，Du XQ，Dichmann DS，et al.Lower blood glucose，hyperglucagonemia，and pancreatic cell hyperplasia in glucagon receptor knockout mice[J].PNAS，2003，100（3）：1438.

[2]Unson CG.Glucagon and the glucagon receptor：merrifield years at the interface of chemistry and biology[J].Int J Pept Res Ther，2007，13（1）：19.

[3]Sloop KW，Cao JX，SieskyAM，et al.Hepatic and glucagon-like peptide-1 mediated reversal of diabetes by glucagon receptor antisense oligonucleotide inhibitors[J].J Clin Invest，2004，113（11）：1571.

[4]Fire A，Xu S，Montgomery MK，et al.Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans[J].Nature，1998，391（6669）：806.

[5]Jagla B，Aulner N，Kelly PD，et al.Sequence characteristics of functional siRNAs[J].RNA，2005，11（6）：864.

[6]Song E，Lee SK，Wang J，et al.RNA interference targeting Fas protects mice from fulminant hepatitis[J].Nat Med，2003，9（3）：347.