克羅卡林對急性腦缺血再灌注大鼠的腦保護(hù)作用

馮 濤 婁季宇 白宏英 楊霄鵬 曾志磊 王金蘭

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450014

腦缺血再灌注后損傷是引起缺血性腦血管?。╥schemic cerebrovascular disease，ICVD）腦功能損害的重要原因。已知很多因素參與再灌注后損傷的過程，其中炎癥反應(yīng)促進(jìn)了繼發(fā)性腦損傷。小膠質(zhì)細(xì)胞（microglia，MG）是腦內(nèi)的主要免疫效應(yīng)細(xì)胞，生理狀況下它對維持腦內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)起重要作用，當(dāng)腦內(nèi)發(fā)生病理損害時(shí)迅速激活產(chǎn)生大量神經(jīng)毒性因子，加速神經(jīng)元的死亡。K－ATP通道開放劑Cromakalin以細(xì)胞內(nèi)的ATP/ADP水平為門控因素、非電壓依賴性的特殊鉀離子通道，廣泛存在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)。它的激活是機(jī)體缺血缺氧狀態(tài)下的自我保護(hù)機(jī)制，可以對抗損害因子對機(jī)體的傷害，若早期用開放劑打開這類通道，可以減輕腦缺血缺氧對神經(jīng)元的損害。

本研究旨在利用大鼠MCAO模型，觀察大鼠急性腦缺血再灌注后海馬區(qū)CA1區(qū)OX42、iNOS的表達(dá)情況，神經(jīng)元特異性尼氏染色法檢測神經(jīng)元數(shù)目及Cromakalin干預(yù)后的變化，為K－ATP通道開放劑盡早應(yīng)用于臨床治療ICVD提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器SD大鼠由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。圖像采集：德國Lecia顯微照像系統(tǒng)。Cromakalin，Sigma美國。分析系統(tǒng)：上海山富科學(xué)儀器有限公司，Biosens Digital Imaging。System v1.6。OX42、iNOS抗體：北京中杉生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組：72只雄性SD大鼠，體質(zhì)量（220±30）g隨機(jī)分為3組：A組為假手術(shù)組，B組為單純?nèi)毖俟嘧⒔M，C組為克羅卡林干預(yù)組，每組24只分6h、24h、72h、7d時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各6只。

1.2.2 動(dòng)物模型制備：應(yīng)用改良Zea Longa線栓法制備大鼠MCAO模型。大鼠蘇醒后參照Zea Longa 5分制標(biāo)準(zhǔn)［1］進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評分，1～3分動(dòng)物入選。

1.2.3 動(dòng)物處理：C組在MCAO后2h給予Cromakalin 0.4mg/（kg·d），2mL腹腔注射，B組在MCAO后2 h給予生理鹽水2 m L腹腔注射，A組除了不插入線栓其他同B組。達(dá)各時(shí)間點(diǎn)后，用10％水合氯醛（350 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，用生理鹽水和4％多聚甲醛進(jìn)行心臟灌注固定，取腦，制作腦部冠狀石蠟切片（厚度4μm）。采用免疫組化染色（SP法），檢測CA1區(qū)OX42、iNOS的表達(dá)情況。各組取7d時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行海馬CA1區(qū)神經(jīng)元尼氏染色，每組取6張切片，在400倍視野下計(jì)數(shù)神經(jīng)元。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組均數(shù)間的比較采用單因素方差分析（one－way，ANOVA），均數(shù)間的兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，以α＝0.05作為顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 海馬CA1區(qū)OX42的表達(dá)情況A組、B組、C組各時(shí)間點(diǎn)海馬CA1區(qū)OX42均有表達(dá)，A組4個(gè)時(shí)間點(diǎn)OX42變化不明顯，B、C兩組OX426h開始表達(dá)，24 h明顯增多，72h達(dá)高峰，7d仍有表達(dá)，明顯高于A組各時(shí)間點(diǎn)（P＜0.05），C組時(shí)間點(diǎn)表達(dá)均少于B組（P＜0.05）。結(jié)果見表1。

表1 各時(shí)間點(diǎn)海馬CA1區(qū)OX－42的平均積分光密度的變化±s）

表1 各時(shí)間點(diǎn)海馬CA1區(qū)OX－42的平均積分光密度的變化±s）

注：▼與 A組相比，P＜0.01；▽與B組相比，P＜0.01

組別6 h 24 h 72 h 7 d A組 95.93±3.03 102.08±4.26 106.27±8.32 100.39±2.92 B組 131.76±5.19▼ 155.73±6.49▼ 174.77±8.09▼147.14±11.87▼C組 118.64±6.36▼▽140.13±4.35▼▽144.13±5.51▼▽123.93±8.47▼▽

2.2 海馬CA1區(qū)iNOS表達(dá)情況A組、B組、C組各時(shí)間點(diǎn)海馬CA1區(qū)iNOS均有表達(dá)，A組4個(gè)時(shí)間點(diǎn)iNOS變化不明顯，B、C兩組6 h開始表達(dá)，24 h明顯增多。72 h達(dá)高峰，7 d仍有表達(dá)，明顯高于A組各時(shí)間點(diǎn)（P＜0.05）。C組各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)均少于B組（P＜0.05）。結(jié)果見表2。

表2 各時(shí)間點(diǎn)海馬CA1區(qū)iNOS的平均積分光密度的變化±s）

表2 各時(shí)間點(diǎn)海馬CA1區(qū)iNOS的平均積分光密度的變化±s）

注：▼與A組相比，P＜0.01；▽與B組相比，P＜0.01

組別6 h 24 h 72 h 7 d A組 93.52±4.16 100.24±6.84 103.38±4.88 98.50±3.72 B組 127.47±3.77▼ 161.97±8.29▼170.86±10.21▼ 146.66±5.97▼C組 115.05±8.27▼▽133.64±7.59▼▽142.43±4.82▼▽121.60±5.97▼▽

2.3 海馬CA1區(qū)神經(jīng)元變化情況A組神經(jīng)元（60.66±6.62）個(gè)，B組神經(jīng)元（11.50±3.08）個(gè)，即在大鼠缺血再灌注7d時(shí)，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的死亡數(shù)目是原有數(shù)目的81.1％，存活數(shù)目是原有數(shù)目的18.9％。C組神經(jīng)元（29.33±4.88）個(gè)，即在大鼠缺血再灌注7d時(shí)，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元存活數(shù)目是原有數(shù)目的48.4％，即保護(hù)了29.5％的神經(jīng)元免于死亡。三組之間差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），結(jié)果見表3。

表3 神經(jīng)元尼氏染色±s，個(gè)/400倍視野）

表3 神經(jīng)元尼氏染色±s，個(gè)/400倍視野）

注：▼與A組相比，P＜0.01；▽與B組比，P＜0.01

組別 n 神經(jīng)元數(shù)目A組6 60.66±6.62 B組 6 11.50±3.08▼C組 6 29.33±4.88▼▽

3 討論

近些年來隨著影像學(xué)在神經(jīng)科的廣泛應(yīng)用，特別是頭顱MRI及DWI在臨床的廣泛應(yīng)用，急性腦梗死后2h內(nèi)即可在影像學(xué)上發(fā)現(xiàn)缺血病灶，為臨床上早期溶栓治療提供了可靠的依據(jù)，腦缺血再灌注損傷也是不能避免［2］。再灌注損傷涉及到多個(gè)病理生理環(huán)節(jié)，其中炎癥反應(yīng)促進(jìn)了繼發(fā)性腦損，是缺血再灌注損傷的重要原因之一。在哺乳動(dòng)物中，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元是腦部缺血容易損傷的區(qū)域之一，所以海馬CA1是研究者經(jīng)常選擇觀測腦部病理變化的區(qū)域之一。

MG在顱內(nèi)分布比較廣泛，是顱內(nèi)的主要免疫效應(yīng)細(xì)胞，大約占膠質(zhì)細(xì)胞的5％～20％［3］。在生理狀態(tài)下對神經(jīng)元有營養(yǎng)、支持、保護(hù)等重要作用，對顱內(nèi)環(huán)境有免疫監(jiān)視和宿主防御的作用。同時(shí)MG對顱內(nèi)的內(nèi)環(huán)境改變及其敏感，特別是感染和創(chuàng)傷時(shí)迅速被激活，形態(tài)上由靜息時(shí)的分支狀到活化的阿米巴樣，細(xì)胞胞體增大，并產(chǎn)生大量的神經(jīng)毒性因子，對神經(jīng)元產(chǎn)生毒性作用，加重對腦部的損害。因此抑制MG的過度激活，具有腦保護(hù)作用。另激活的MG是iNOS的主要來源。iNOS是人體內(nèi)一種重要的合酶，在生理?xiàng)l件下并不表達(dá)，只在病理情況下如腦缺血再灌注損傷時(shí)，iNOS可以出現(xiàn)在炎性細(xì)胞、神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及微血管內(nèi)皮細(xì)胞中，一旦誘導(dǎo)合成，就持續(xù)大量產(chǎn)生一氧化氮（NO）。NO是一種化學(xué)性質(zhì)活潑的自由基，兼有細(xì)胞毒性作用，過量持續(xù)的表達(dá)是腦缺血再灌注損傷的一個(gè)重要因素，因此iNOS是腦缺血再灌注損傷產(chǎn)生過量NO的基礎(chǔ)。

K－ATP通道是1983年Noma［4］首先發(fā)現(xiàn)存在于豚鼠心肌細(xì)胞膜上，現(xiàn)已經(jīng)證明它也廣泛存在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，同樣也存在小膠質(zhì)細(xì)胞上。在正常生理狀態(tài)下腦內(nèi)的K－ATP通道處于關(guān)閉狀態(tài)，當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)缺血缺氧、炎癥反應(yīng)等時(shí)，KATP通道開放，鉀離子大量外流，細(xì)胞出現(xiàn)超極化狀態(tài)，神經(jīng)元的興奮性降低，調(diào)節(jié)鈣離子的平衡，穩(wěn)定線粒體膜電位，抑制凋亡等，是機(jī)體的一種重要自我保護(hù)機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)觀察應(yīng)用K－ATP通道開放劑Cromakalin干預(yù)大鼠腦缺血再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)OX42、iNOS表達(dá)的變化，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用Cromakalin干預(yù)后，OX42、iNOS的表達(dá)明顯低于腦缺血再灌注組，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元存活數(shù)目Cromakalin干預(yù)組明顯多于非干預(yù)組。說明K－ATP通道開放劑Cromakalin可通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的過度激活、iNOS的過度表達(dá)，保護(hù)腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元遲發(fā)性死亡等方面保護(hù)神經(jīng)元，從而起到腦保護(hù)的作用。

［1］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20（l）：84－91.

［2］李建章，主編.神經(jīng)科醫(yī)師手冊［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2010：161－183.

［3］彭玲梅，黃泳.小膠質(zhì)細(xì)胞在阿爾茨海默病炎性反應(yīng)中的雙重作用［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2009，15（19）：2 889－2 890.

［4］Noma A.ATP－regulated K＋channels in cardiac muscle［J］.Natuer，1983，305（5930）：147－148.