1-磷酸鞘氨醇預(yù)處理對(duì)缺氧/復(fù)氧乳鼠心肌細(xì)胞磷酸化Akt1水平的影響

袁磊 韓坤(漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校,河南 漯河 462002)

1-磷酸鞘氨醇(Sphingosine-1-phosphate,S1P)是近年來發(fā)現(xiàn)的具有重要生理功能的一種膜磷脂類代謝產(chǎn)物。研究證實(shí),S1P可通過相應(yīng)受體激活PI3K-Akt信號(hào)通路,進(jìn)而減輕缺血再灌注損傷[1,2]。Akt是S1P發(fā)揮心肌保護(hù)作用的關(guān)鍵分子。本研究通過建立缺氧/復(fù)氧乳鼠心肌細(xì)胞損傷模型,觀察1-磷酸鞘氨醇(Sphingo-sine-1-phosphate,S1P)預(yù)處理對(duì)缺氧/復(fù)氧乳鼠心肌細(xì)胞磷酸化Akt1水平的影響,探究S1P是否還通過激活A(yù)kt1進(jìn)而減輕心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷,保護(hù)心肌細(xì)胞。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

出生72h內(nèi)的大鼠乳鼠,雌雄均可,狀態(tài)良好,購(gòu)于鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,動(dòng)物合格證號(hào)：醫(yī)動(dòng)字010346號(hào)。

1.2 藥品

DMEM高糖培養(yǎng)(長(zhǎng)春博德生物公司);新生小牛血清(武漢三利生物);胰蛋白酶(美國(guó)Amresco);1-磷酸鞘氨醇(S1P)、渥曼青霉素(Wortmannin)、兔抗鼠磷酸化 Akt1抗體(Thr473)和辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(Sigma)。

1.3 方法

1.3.1 大鼠乳鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)

將出生72h內(nèi)的大鼠乳鼠心室肌剪碎,用0.125%胰蛋白酶進(jìn)行消化,利用差速貼壁法純化心肌細(xì)胞,加入20%DM EM培養(yǎng)基,送37℃、95%O2+5%CO2的二氧化碳孵育箱中培養(yǎng),每隔24h更換一次細(xì)胞培養(yǎng)液,待單層心肌細(xì)胞覆蓋瓶底達(dá)80%以上時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 制備缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞損傷模型

待心肌細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合狀態(tài)時(shí)(72h),更換細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)12h,使細(xì)胞同步化;然后置于92%N2及5%CO2孵箱中缺氧6h再恢復(fù)正常條件培養(yǎng)4h,造成缺氧/復(fù)氧損傷所致細(xì)胞凋亡模型。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)分組及給藥

實(shí)驗(yàn)分成三組：正常對(duì)照組(Control group),缺氧/復(fù)氧組(H/R group),S1P預(yù)處理缺氧/復(fù)氧組(S1P+H/R group),自模型制作前2d開始,每天實(shí)施S1P預(yù)處理2h,S1P終濃度為2.0μ mol?L-1。

1.3.4 臺(tái)盼蘭排斥法檢測(cè)細(xì)胞死亡率

將細(xì)胞懸液和0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液按1：1體積比混合后加蓋玻片,1min后計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞,活細(xì)胞透明,死細(xì)胞染成藍(lán)色,著色細(xì)胞數(shù)計(jì)為N,用死細(xì)胞占計(jì)數(shù)細(xì)胞中的百分比表示細(xì)胞死亡率,即(N/100)×100%。

1.3.5 心肌細(xì)胞內(nèi)磷酸化Akt1含量檢測(cè)

采用Western Blot方法。提取各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)總蛋白,進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,按目的蛋白的位置來切膠;將目的蛋白從SDS聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,封閉PVDF膜;依次加入一抗(兔抗鼠磷酸化 Akt抗體)和二抗(辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG),以上步驟之間均充分孵育和洗滌;然后將PVDF膜放入顯色液進(jìn)行顯色,并拍照保存;用圖像分析軟件檢測(cè)蛋白區(qū)積分光密度值(Iintegrated optical density,IOD),用蛋白區(qū)IOD值表示各組蛋白表達(dá)量,以p-Akt1與Tublin的積分光密度比值(R值)作為p-Akt1的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 S1P預(yù)處理對(duì)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞死亡率的影響

H/R組較Control組細(xì)胞死亡率顯著升高(P＜0.001);S1P+H/R組細(xì)胞較H/R組死亡率顯著降低(P＜0.002),這表明S1P預(yù)處理能夠明顯減輕缺氧/復(fù)氧損傷保護(hù)心肌作用。結(jié)果見表1。

表1 各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞死亡率(,n=3)

表1 各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞死亡率(,n=3)

注：與對(duì)照組相比,＊P＜0.005,＊＊P＜0.001;與缺氧復(fù)氧組相比,#P＜0.002

組別 細(xì)胞死亡率(%)對(duì)照組 1.52±2.13缺氧復(fù)氧組 47.14±2.66＊＊S1P預(yù)處理+缺氧復(fù)氧組 21.42±2.72＊#

2.2 Tublin(微管蛋白)和磷酸化Akt1的蛋白質(zhì)印跡

內(nèi)參蛋白Tublin的分子量為51kd,磷酸化Akt1(p-Akt1)是分子量為60kd的蛋白質(zhì)分子。Tublin和p-Akt1的western blot結(jié)果如圖1。

圖1 WesternBlot測(cè)定 Tublin和 p-Akt1的蛋白表達(dá)情況

2.3 分析蛋白條帶的積分光密度值和R值

以p-Akt1與Tublin的IOD比值(R值)作為 p-Akt1的相對(duì)表達(dá)量(表2)。結(jié)果顯示,Control組R值最低,這表明在正常心肌細(xì)胞內(nèi)僅有少量Akt1被活化;H/R組R值較Control組輕度升高(P＜0.05),這表明缺氧復(fù)氧刺激能夠輕度激活A(yù)kt1;S1P+H/R組R值較 H/R組顯著升高(P＜0.01),說明S1P預(yù)處理能夠顯著提高Akt1的磷酸化水平。

表2 Tublin和p-Akt蛋白條帶的積分光密度值和R值(,n=3)

表2 Tublin和p-Akt蛋白條帶的積分光密度值和R值(,n=3)

注 ：與對(duì)照組相比,＊P＜0.05,＊＊P＜0.001;與缺氧復(fù)氧組相比,#P＜0.001

組別 IOD Tublin p-Akt1R對(duì)照組 170.33±2.58 31.326±0.736 0.1838±0.0031缺氧復(fù)氧組 171.11±2.16 33.494±0.919 0.1957±0.0033＊S1P預(yù)處理 +缺氧復(fù)氧組 169.23±2.37 116.90±1.47 0.6908±0.0018＊＊##

3 討論

1-磷酸鞘氨醇(Sphingosine-1-phosphate,S1P)是近年來發(fā)現(xiàn)的具有重要生理功能的一種膜磷脂類代謝產(chǎn)物。它既可作為一種細(xì)胞內(nèi)第二信使,又可作用于細(xì)胞膜表面特定的受體而發(fā)揮其重要的生物學(xué)功能。S1P與細(xì)胞的多種生命活動(dòng)密切相關(guān),包括細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和遷移等。

近年研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡是心肌缺血再灌注損傷過程中心肌細(xì)胞死亡的重要機(jī)制之一,而PI3K-Akt信號(hào)通路正是近年來備受關(guān)注的凋亡抑制通路之一。研究證實(shí),S1P可通過與S1P2受體和S1P3受體結(jié)合,激活 PI3K-Akt信號(hào)通路,使細(xì)胞內(nèi)磷酸化Akt水平升高,進(jìn)而減輕缺血再灌注損傷,抑制心肌細(xì)胞凋亡,發(fā)揮心肌保護(hù)作用[1,2]。Akt的下游信號(hào)包括：Bad、caspase-9 、GSK3 、FH 轉(zhuǎn)錄因子、Iκ B 激酶。 目前對(duì) Akt的抗凋亡機(jī)制更傾向于其維持線粒體膜的完整性,Akt可使Bcl-2家族成員Bad的Ser136磷酸化而促使它和14-3-3蛋白結(jié)合,Bcl-2或Bcl-xL得以脫離Bad的抑制,調(diào)節(jié)線粒體通透性,阻止細(xì)胞色素C(CytC)和凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)的釋放,發(fā)揮抗凋亡作用,這可能是Akt促進(jìn)細(xì)胞存活的重要機(jī)制之一[3]。

本研究以缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞損傷模型為研究對(duì)象,采用Western Blot方法,通過檢測(cè)心肌細(xì)胞內(nèi)磷酸化Akt1水平,旨在探究S1P是否能通過非PI3K依賴的信號(hào)通路激活A(yù)kt1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,H/R組R值較Control組輕度升高(P＜0.05),這表明缺氧復(fù)氧刺激能夠輕度激活A(yù)kt1,但意義不大;H/R+S1P組磷酸化Akt1水平在各實(shí)驗(yàn)組中最高(P＜0.001),這表明S1P能夠顯著提高缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞內(nèi)Akt1的磷酸化水平;當(dāng)加入PI3K抑制劑Wortmannin后,PI3K受到抑制,Akt1是PI3K的下游分子,則Akt1的激活也被Wortmannin抑制,心肌細(xì)胞內(nèi)磷酸化Akt1含量較H/R+S1P組明顯下降(P＜0.001),但H/R+S1P+W組心肌細(xì)胞內(nèi)磷酸化Akt1水平仍較H/R組高(P＜0.001),這說明Wortmannin僅能部分阻斷S1P對(duì)Akt1的活化。

綜上所訴,S1P對(duì)Akt1的激活還存在著非PI3K依賴的信號(hào)通路,這也將為進(jìn)一步探索S1P誘導(dǎo)的心肌保護(hù)作用機(jī)制提供了新思路。

1 Means CK,Xiao CY,Li ZJ,et al.Sphingosine-1-phosphate S1P(2)and S1P(3)receptor-mediated Akt activation protects against in vivo myocardial ischemia-reperfusion injury[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2007,292(6)：H2944-H2951.

2 Del Re DP,Miyamoto S,Brown JH.Focal Adhesion Kinase as aR-hoA-activable Signaling Scaffold Mediating Akt Activation and Cardiomyocyte Protection[J].J Biol Chem,2008,283(51)：35622-35629.

3 Downward J.How BAD phosphorylation is good for survival[J].Nat Cell Biol,1999,1(2)：E33-E35.