磷酸鞘氨醇對(duì)胰腺癌PANC1細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響

田波　隋淑靜　孟茜茜　劉培培　林寒　辛磊　李兆申　王洛偉

200433　上海，第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院消化內(nèi)科(田波、孟茜茜、劉培培、林寒、辛磊、李兆申、王洛偉)；泰安市中心醫(yī)院消化內(nèi)一科(隋淑靜)

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·論著·

磷酸鞘氨醇對(duì)胰腺癌PANC1細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響

田波隋淑靜孟茜茜劉培培林寒辛磊李兆申王洛偉

200433上海，第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院消化內(nèi)科(田波、孟茜茜、劉培培、林寒、辛磊、李兆申、王洛偉)；泰安市中心醫(yī)院消化內(nèi)一科(隋淑靜)

【摘要】目的觀察磷酸鞘氨醇(S1P)干預(yù)對(duì)胰腺癌PANC1細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響。方法采用20、40、80、100、150、200 nmol/L S1P干預(yù)PANC1細(xì)胞24 h，以未干預(yù)細(xì)胞作為對(duì)照組。另采用S1P特異性受體拮抗劑VPC23019 10 μmol/L 預(yù)處理1 h后再應(yīng)用100 nmol/L S1P干預(yù)PANC1細(xì)胞24 h(VPC+S1P組)，同時(shí)設(shè)單用S1P干預(yù)(S1P組)、單用VPC23019處理(VPC組)及未處理的對(duì)照組。采用熒光定量PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)各組細(xì)胞N-Cadherin mRNA和蛋白表達(dá)，采用劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞的遷移、侵襲能力。結(jié)果對(duì)照組及20、40、80、100、150、200 nmol/L S1P干預(yù)組細(xì)胞N-Cadherin mRNA表達(dá)量分別為1.000±0.061、1.240±0.106、1.547±0.085、1.827±0.114、2.160±0.164、1.767±0.146、1.493±0.163，以100 nmol/L S1P干預(yù)組的表達(dá)量最高，各干預(yù)組均顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。對(duì)照組、S1P組、VPC組、VPC+S1P組細(xì)胞N-Cadherin mRNA表達(dá)量分別為1.000±0.114、2.273±0.341、0.920±0.096、0.340±0.110；對(duì)照組、S1P組、VPC+S1P組N-Cadherin蛋白表達(dá)量分別為1.000±0.176、2.167±0.242、0.510±0.151，細(xì)胞遷移率分別為(32.5±2.6)%、(57.5±3.3)%、(11.2±3.5)%，穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(79±4.3)、(168±5.7)、(55±3.7)個(gè)/200倍視野。S1P組較對(duì)照組顯著增加，VPC+S1P組較S1P組及對(duì)照組顯著減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。結(jié)論S1P干預(yù)可增強(qiáng)胰腺癌PANC1細(xì)胞的遷移、侵襲能力，應(yīng)用S1P特異性受體拮抗劑VPC23019預(yù)處理可完全阻斷S1P的作用，其機(jī)制可能與下調(diào)N-Cadherin基因表達(dá)有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】胰腺腫瘤；鞘氨醇；VPC23019；N-Cadherin；細(xì)胞系，腫瘤

Fund program：Natural Science Foundation of China(30700360)

磷酸鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate，S1P)是細(xì)胞膜鞘磷脂的代謝產(chǎn)物，通過與S1P異三聚體G蛋白耦聯(lián)受體(S1PR)結(jié)合介導(dǎo)機(jī)體炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖遷移、血管生成等多種生理活動(dòng)，同時(shí)在多種惡性腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中具有重要作用。研究表明，當(dāng)S1P與S1PR1/S1PR3結(jié)合時(shí)，腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力提高，而沉默受體表達(dá)或拮抗受體的方法可以有效降低S1P誘導(dǎo)的腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。N-Cadherin是連接細(xì)胞骨架、增強(qiáng)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性的鈣黏蛋白，與腫瘤細(xì)胞間黏附蛋白的表達(dá)、微血管生成密切相關(guān)[1]。正常細(xì)胞從緊密連接的極性上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為非極性的、能自由侵襲的細(xì)胞時(shí)N-Cadherin表達(dá)相應(yīng)增加，抑制N-Cadherin的表達(dá)可以降低腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的能力[2-3]。因此，本研究應(yīng)用S1P特異性受體拮抗劑VPC23019處理S1P刺激后的胰腺癌PANC1細(xì)胞，觀察其對(duì)癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響，探討其可能機(jī)制。

材料和方法

一、熒光定量PCR法檢測(cè)細(xì)胞N-Cadherin mRNA表達(dá)

人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC1為長(zhǎng)海醫(yī)院保存，常規(guī)培養(yǎng)、傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，待培養(yǎng)至70%融合狀態(tài)時(shí)用無血清DMEM培養(yǎng)過夜。加入終濃度為20、40、80、100、150、200 nmol/L的S1P(Sigma公司)干預(yù)24 h，以未處理細(xì)胞作為對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。另取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，分為對(duì)照組、S1P組、VPC組、VPC+S1P1組、VPC+S1P2組。S1P組應(yīng)用100 nmol/L S1P干預(yù)24 h，VPC組應(yīng)用10 μmol/L VPC23019處理24 h，VPC+S1P1組、VPC+S1P2組分別用1、10 μmol/L VPC23019預(yù)處理1 h后再應(yīng)用100 nmol/L S1P干預(yù)24 h，以未處理細(xì)胞作為對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

收集上述各組細(xì)胞，采用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA,先逆轉(zhuǎn)成cDNA，再行熒光定量PCR檢測(cè)N-Cadherin mRNA表達(dá)量。N-Cadherin引物序列為5′-AGCCAACCTTAACTGAGGAGT-3′和5′-GGCAAG-TTGATTGGAGGGATG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物136 bp；內(nèi)參GAPDH引物序列為5′-ATGACATCAAGAAGGTGGTG-3′和5′-CATACCAGGAAATGAGCTTG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物197 bp。引物由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)參數(shù)：95℃ 20 s，95℃ 10 s、60℃ 20 s、72℃ 10 s，40次循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。由儀器自帶軟件獲取Ct值，以對(duì)照組細(xì)胞N-Cadherin mRNA表達(dá)量為1，計(jì)算處理組細(xì)胞N-Cadherin mRNA相對(duì)表達(dá)量。

二、劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以5×105/孔接種于6孔板，分為對(duì)照組、S1P組、VPC+ S1P組(VPC預(yù)處理濃度為10 μmol/L)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)至約90%融合時(shí)棄去培養(yǎng)液，用10 μl的移液槍頭在平板中間劃一條橫線，PBS沖洗3次，按上述分組配制無血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。在處理當(dāng)時(shí)(0 h)及培養(yǎng)24 h時(shí)測(cè)量劃痕的距離。

細(xì)胞遷移率=[(0 h劃痕距離-24 h劃痕距離)/0 h劃痕距離]×100%

三、Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力

Transwell小室購(gòu)自Costar公司。每個(gè)小室的聚碳酸酯膜上加50 μl用無血清DMEM培養(yǎng)液稀釋的Matrigel，待其充分聚合，Transwell下室加入600 μl含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液，Transwell上室加100 μl用無血清DMEM培養(yǎng)液稀釋的5×105/ml的細(xì)胞懸液。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、S1P組、VPC+S1P組(VPC預(yù)處理濃度為10 μmol/L)，每組3個(gè)小室。培養(yǎng)48 h后取出Transwell小室隔膜，用棉簽拭去膜表面的Matrigel，無水乙醇固定細(xì)胞，PBS沖洗晾干，然后用0.1%結(jié)晶紫染色10 min，去除多余結(jié)晶紫染液，光鏡下隨機(jī)選取5個(gè)200倍視野，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，取均值。

四、蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)N-Cadherin蛋白表達(dá)

取上述各組培養(yǎng)48 h的PANC1細(xì)胞，用RIPA裂解液制備細(xì)胞總蛋白，測(cè)定蛋白濃度，常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)N-Cadherin蛋白表達(dá)，以β-actin為內(nèi)參。兔抗人N-Cadherin、β-actin抗體均購(gòu)自Abcam公司，工作濃度分別為1∶5 000,1∶3 000。最后ECL顯影，膠片曝光、顯影、定影。用凝膠圖像軟件分析系統(tǒng)掃描膠片，以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比表示蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果

一、各組PANC1細(xì)胞N-Cadherin mRNA表達(dá)量的變化

對(duì)照組細(xì)胞N-Cadherin mRNA表達(dá)量為1.000±0.061；20、40、80、100、150、200 nmol/L S1P干預(yù)組細(xì)胞N-Cadherin mRNA表達(dá)量分別為1.240±0.106、1.547±0.085、1.827±0.114、2.160±0.164、1.767±0.146、1.493±0.163，其中100 nmol/L S1P干預(yù)組的表達(dá)量最高。各干預(yù)組均顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別0.027、0.001、0.000、0.000、0.001、0.008)。

VPC23019預(yù)處理實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組、S1P組、VPC組、VPC+S1P1組、VPC+S1P2組細(xì)胞N-Cadherin mRNA表達(dá)量分別為1.000±0.114、2.273±0.341、0.920±0.096、0.617±0.057、0.340±0.110。VPC組與對(duì)照組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.405)。S1P組較對(duì)照組顯著增加，VPC+S1P1組、VPC+S1P2組較S1P組顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P值分別為0.004、0.006、0.002)。

二、各組PANC1細(xì)胞N-Cadherin蛋白表達(dá)量的變化

對(duì)照組、S1P組、VPC+S1P組N-Cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.000±0.176、2.167±0.242、0.510±0.151。S1P組較對(duì)照組顯著增加，VPC+S1P組較S1P組及對(duì)照組均顯著減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.003、0.001、0.022)。

三、各組PANC1細(xì)胞遷移能力的變化

對(duì)照組、S1P組、VPC+S1P組細(xì)胞遷移率分別為(32.5±2.6)%、(57.5±3.3)%、(11.2±3.5)%，S1P組較對(duì)照組顯著增加，VPC+S1P組較S1P組及對(duì)照組均顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.001、0.000、0.001)，見圖1。

圖1　對(duì)照組(上)、S1P組(中)、VPC+S1P組(下)細(xì)胞遷移情況(×40)

四、各組PANC1細(xì)胞侵襲能力的變化

對(duì)照組、S1P組、VPC+S1P組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(79±4.3)、(168±5.7)、(55±3.7)個(gè)/200倍視野。S1P組穿膜細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組顯著增加，VPC+S1P組較S1P組及對(duì)照組均顯著減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.000、0.006、0.000)，見圖2。

討論

脂類代謝的異常與胰腺癌的發(fā)生和發(fā)展關(guān)系密切，許多脂類及脂代謝關(guān)鍵酶的血漿濃度和胰腺癌患者的病理分期、對(duì)放化療的敏感性及預(yù)后密切相關(guān)[4-5]。S1P是一種由細(xì)胞膜鞘磷脂受鞘氨醇激酶催化生成的代謝產(chǎn)物，通過與細(xì)胞膜表面S1P受體(S1PR)結(jié)合，發(fā)揮生物學(xué)作用。S1PR為G蛋白耦聯(lián)受體家族成員，迄今共發(fā)現(xiàn)5型,其中S1PR1～3廣泛分布于人體各種組織中，對(duì)血管生成、免疫調(diào)節(jié)等機(jī)體生理活動(dòng)起著重要作用[4-5]。血漿中S1P大部分以與脂蛋白結(jié)合的形式存在，極少部分為游離狀態(tài)。以往多項(xiàng)研究[6-8]證明，S1P通過與乳腺癌、前列腺癌等惡性腫瘤細(xì)胞表面受體結(jié)合影響腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲、轉(zhuǎn)移能力，其生物學(xué)活性受結(jié)合受體類型、S1P濃度等因素影響。當(dāng)S1P與S1PR1、3兩個(gè)受體相結(jié)合時(shí)會(huì)增加腫瘤的惡性程度，而與S1PR2結(jié)合則可拮抗該作用。Sutphen等[9]報(bào)道，卵巢癌患者血漿S1P濃度與腫瘤惡性進(jìn)程密切相關(guān)，腫瘤切除后血漿S1P濃度明顯下降。

圖2對(duì)照組(2A)、S1P組(2B)、VPC+S1P組(2C)穿膜細(xì)胞(×40)

N-Cadherin是一種在細(xì)胞膜之間接觸層面高表達(dá)，并且可以內(nèi)在連接細(xì)胞骨架，增強(qiáng)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性的鈣黏蛋白，其高表達(dá)可以導(dǎo)致胰腺癌轉(zhuǎn)移侵襲能力增強(qiáng)、腫瘤的分化程度降低等，是胰腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的重要作用分子[2]。VPC23019為一種人工合成的S1PR1、3受體拮抗劑，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與S1P有一定的相似，可以特異性抑制S1P與S1PR1、3的結(jié)合，阻滯部分S1P下游通路的激活[10]。

本研究結(jié)果顯示，S1P干預(yù)PANC1細(xì)胞后，N-Cadherin蛋白表達(dá)量增加，以100 nmol/L S1P干預(yù)時(shí)的表達(dá)量增加最明顯，同時(shí)PANC1細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。單用VPC處理PANC1細(xì)胞，N-Cadherin mRNA表達(dá)不受影響，但用VPC預(yù)處理后再用S1P干預(yù)細(xì)胞時(shí)N-Cadherin mRNA及蛋白表達(dá)量較單用S1P干預(yù)組顯著下降，細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力顯著被抑制，而且也較對(duì)照組細(xì)胞下降，提示S1P干預(yù)PANC1細(xì)胞后通過增加N-Cadherin基因表達(dá)而抑制癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力，用S1PR1、3受體拮抗劑預(yù)處理則可完全阻斷S1P的作用。因此，采用特異性阻滯S1P通路抑制胰腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力可能成為治療胰腺癌的新靶點(diǎn)。

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(本文編輯：呂芳萍)

The influence of sphingosine 1-phosphate on migration and invasion of pancreatic cancer PANC1 cells

TiaoBo,SuiShujing,MengQianqian,LiuPeipei,LinHan,XinLei,LiZhaoshen,WangLuowei.DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai, 200433China

【Abstract】ObjectiveTo observe the influence of sphingosine 1-phosphate (S1P) on cell migration and invasion in pancreatic cancer PANC1 cells. MethodsDifferent concentrations (20, 40, 80, 100, 150, 200 nmol/L) of S1P was used to treat PANC1 cells for 24 h and untreated cells were used as control. Cells were pretreated by 10 μmol/L VPC23019 for 1 h and then treated by 100 nmol/L S1P in VPC+S1P group, only treated by S1P in S1P group, and only treated by VPC23019 in VPC group, and untreated in control group. Fluorescent quantitative PCR and Western blot were used to detect N-Cadherin mRNA and protein expression, and wound healing test and transwell chambers were used to detect cell migration and invasion.

ResultsN-Cadherin mRNA expression in control, 20, 40, 80, 100, 150, 200 nmol/L S1P group was 1.000±0.061,1.240±0.106,1.547±0.085,1.827±0.114,2.160±0.164,1.767±0.146,1.493±0.163, and 100 nmol/L S1P stimulated the highest N-Cadherin expression. N-Cadherin mRNA expression in control, S1P, VPC and VPC+S1P group was 1.000±0.114,2.273±0.341, 0.920±0.096, 0.340±0.110, respectively. N-Cadherin protein expression in control, S1P, VPC+S1P group was 1.000±0.176, 2.167±0.242, 0.510±0.151; cell migration rate was (32.5±2.6)%, (57.5±3.3)%,(11.2±3.5)%; and the transmembrane cell numbers were 79±4.3,168±5.7, 55±3.7 cell2 in each view a maginification of 200 times. Cell migration and invasion in S1P group were significantly increased, and those in VPC+S1P group were dicreased when compared with S1P and control group (allP<0.05). ConclusionsS1P can increase the migration and invasion ability of PANC1 cells, and pretreatment of S1P specific inhibitor VPC23019 could completely abolish the function of S1P.The molecular mechanism may be associated with reducing the expression of N-Cadherin.

【Key words】Pancreatic neoplasms；Sphingosine；VPC23019；N-Cadherin；Cell line, tumor

(收稿日期：2015-12-29)

Corresponding author:Wang Luowei, Email: phdwang@hotmail.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(30700360)

通信作者：王洛偉，Email:phdwang@hotmail.com

DOI:10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2016.02.001

共同第一作者：隋淑靜