SAMP8鼠背海馬 synaptotagm inⅣ的年齡效應(yīng)與分布

王龍海, 陳貴海, 楊啟綱, 張 瓊 (安徽中醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室, 合肥 30038; 安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科)

突觸結(jié)合蛋白 synaptotagmin(Syt)屬于突觸前囊泡蛋白,是涉及神經(jīng)遞質(zhì)釋放過(guò)程和腦的學(xué)習(xí)記憶等生理功能的關(guān)鍵蛋白之一[1]。該蛋白家族在嚙齒類(lèi)和人類(lèi)中已經(jīng)發(fā)現(xiàn) 16種亞型[2],其中在腦組織內(nèi)表達(dá)的 Syt有 SytⅠ -Ⅶ、Ⅸ -Ⅺ、Ⅷ。由于 Syt不同亞型在組織分布、與二價(jià)金屬離子的結(jié)合、鈣離子誘導(dǎo)的與磷脂及 t-SNARE結(jié)合的動(dòng)力學(xué)等方面有所不同,所以 Syt不同亞型在生物學(xué)功能上也存在差異[3-5]。目前有資料表明,基因突變小鼠腦內(nèi)海馬 SytⅣ的水平與腦衰老的進(jìn)程以及年齡相關(guān)的學(xué)習(xí)記憶功能等相關(guān)[6],但正常衰老的小鼠海馬內(nèi)SytⅣ的水平如何變化,以及 SytⅣ在 SAMP8鼠海馬亞區(qū)的分布狀況均未見(jiàn)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本實(shí)驗(yàn)小鼠為 SAMP8鼠,購(gòu)自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(普通級(jí)),常規(guī)條件下喂養(yǎng)。SAMP8鼠分為 3個(gè)年齡組:①青年組:4.5月齡,22只;②中年組:9月齡,23只;③老年組:13月齡,19只。在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前對(duì)小鼠進(jìn)行篩選,有運(yùn)動(dòng)障礙、白內(nèi)障、脫毛及體表可見(jiàn)明顯腫塊的小鼠被排除。所有小鼠接受標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類(lèi)食物,自由飲水。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前 4周,將小鼠飼養(yǎng)于檢測(cè)室里,每天接觸一次(拎尾、撫摸)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間,動(dòng)物可得到足夠的食物和水。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑 一抗為兔抗小鼠 SytⅣ蛋白單克隆抗體,購(gòu)于美國(guó) Sigma公司。二抗為 SP超敏試劑盒(SP-9001,生物素標(biāo)記羊抗兔/小鼠 IgG),購(gòu)于北京中杉金橋生物科技有限公司。DAB顯色試劑盒也為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器裝置 石蠟切片機(jī)(RM2235型),德國(guó) Leica公司。組織芯片點(diǎn)樣儀及配套點(diǎn)樣針(內(nèi)徑 1.0 mm),朝陽(yáng)恒泰科技發(fā)展有限公司。光學(xué)顯微鏡(Nikon ECLIPSE 80i)及彩色數(shù)碼 CCD攝像頭照相機(jī),日本 Nikon公司。圖像分析系統(tǒng)(Image-Pro Plus6.0),美國(guó) Media Cygernetics公司 。

1.4 制備腦組織芯片小鼠引頸脫臼處死,冰上迅速開(kāi)顱取腦,置于 4%的多聚甲醛溶液中固定、流水沖洗、修塊、脫水、透明與浸蠟、HE染色定位海馬,以組織點(diǎn)樣針套取含海馬的適合腦組織芯、二次包埋制作組織芯片。

1.5 免疫組化染色、攝片及圖像分析 采用超敏SP法免疫組化染色,鏡下攝片?？瞻讓?duì)照以 PBS代替一抗 SytⅣ;陽(yáng)性對(duì)照以已知 SytⅣ的陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照。攝片以光學(xué)顯微鏡拍攝 SAMP8鼠海馬CA3和 DG區(qū)圖像,以圖像分析系統(tǒng) Image-Pro Plus 6.0對(duì) CA3和 DG區(qū)進(jìn)行光密度值測(cè)定和分析。由于測(cè)定框選取區(qū)域的大小形狀不同,故以平均光密度值(mean optical density,MOD)作為分析指標(biāo),并以此平均光密度值作為 SytⅣ的相對(duì)水平指標(biāo)。

2 結(jié)果

2.1 SytⅣ蛋白在 SAMP8小鼠海馬內(nèi)的表達(dá) 空白對(duì)照結(jié)果為陰性;陽(yáng)性對(duì)照顯示 SytⅣ蛋白免疫反應(yīng)為陽(yáng)性,鏡下陽(yáng)性染色呈棕黃色至棕褐色不等,背景為淡黃色或無(wú)色。光鏡下觀察組織芯片背海馬區(qū)結(jié)構(gòu),SytⅣ在不同年齡組小鼠背海馬的各亞區(qū)均有表達(dá)(圖 1),其中 CA3、CA1區(qū)的起層、輻射層或透明層 SytⅣ的表達(dá)較弱,分子層表達(dá)稍強(qiáng),而整個(gè)背海馬的 CA3、CA1區(qū)錐體細(xì)胞和 DG區(qū)顆粒細(xì)胞的胞膜呈高表達(dá);青年組 SAMP8小鼠 CA 3區(qū)、CA1和 DG區(qū) SytⅣ較老年組小鼠呈較高表達(dá)(圖2,見(jiàn)第 578頁(yè))。

圖1 SytⅣ蛋白在小鼠背海馬的表達(dá)(SP,×40)Fig 1 The expression of SytⅣin the dorsal hippocampus of themice(SP,×40)

2.2 SytⅣ表達(dá)結(jié)果的圖像分析 三組 SAMP8小鼠在背海馬 DG、CA1和 CA3區(qū)突觸蛋白 SytⅣ相對(duì)含量的年齡效應(yīng)見(jiàn)圖 3。4.5月齡青年 SAMP8小鼠背海馬 DG、CA1和 CA3區(qū)的 SytⅣ相對(duì)含量高于13月齡老年和 9月齡中年 SAMP8小鼠(P＜0.05)。9月齡 SAMP8小鼠背海馬 SytⅣ的相對(duì)含量也高于13月齡鼠,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

圖2 不同年齡小鼠背海馬 DG和CA 1區(qū)SytⅣ的免疫組化表達(dá)(×400)Fig 2 The immunohistochemical stainingof SytⅣ in the DG and CA 1 in the dorsal hippocampus for differentagem ice(×400)

圖3 不同年齡 SAMP8鼠在背海馬不同亞區(qū)SytⅣ的相對(duì)含量Fig 3 The relative amount of SytⅣin the DG,CA3 and CA1 of dorsal hippocampus for different-agemice

3 討論

腦內(nèi)各區(qū)域的衰老改變并不一致。其中,海馬和額葉是衰老過(guò)程中的易損區(qū)域,海馬主要參與空間記憶和事件記憶的形成。海馬內(nèi)不同亞區(qū)的纖維聯(lián)系有所不同。因此,了解 SytⅣ在小鼠背海馬不同亞區(qū)分布情況,對(duì)于探討 SytⅣ的生物學(xué)功能有重要價(jià)值。Dean等發(fā)現(xiàn)SytⅣ集中在海馬神經(jīng)元中包含小囊泡的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF),位于胞體突觸和胞樹(shù)突觸[7]。也有研究者證實(shí)在未分化的嗜鉻細(xì)胞瘤(pheochromocytoma,PC12)細(xì)胞中,SytⅣ定位于高爾基體上,用神經(jīng)生長(zhǎng)因子刺激細(xì)胞分化后,SytⅣ定位于致密核心大囊泡上[8],在果蠅的突觸囊泡上也發(fā)現(xiàn)了 SytⅣ的同源體。楊帆等運(yùn)用全內(nèi)反射熒光顯微系統(tǒng),發(fā)現(xiàn) SytⅣ與 SytⅠ在LβT2細(xì)胞中與致密核心大囊泡(large dense-cored vesicles,LDCVs)有共存現(xiàn)象,且共存比例很大[9]。

本研究發(fā)現(xiàn),SytⅣ在 SAMP8鼠背海馬的 CA3、CA1區(qū)錐體細(xì)胞和 DG區(qū)顆粒細(xì)胞中均有表達(dá),其中在小鼠背海馬的CA3、CA1區(qū)的起層、輻射層或透明層表達(dá)較弱,分子層表達(dá)稍強(qiáng),背海馬的 CA3、CA1區(qū)錐體細(xì)胞和 DG區(qū)顆粒細(xì)胞的胞膜呈高表達(dá)。這提示 SytⅣ可能在海馬錐體細(xì)胞和顆粒細(xì)胞的神經(jīng)元細(xì)胞體與軸突或樹(shù)突之間的突觸中含量較高,即 SytⅣ是樹(shù) -體式突觸和軸 -體式突觸內(nèi)主要的突觸囊泡蛋白。另外,本研究還發(fā)現(xiàn) SytⅣ在背海馬的分布部位未隨年齡變化而變化,由此可以推測(cè) SytⅣ在背海馬的分布部位可能相對(duì)穩(wěn)定。

SytⅣ,是 Syt家族的第四個(gè)成員,也是一種膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[7]。它的氨基酸序列是現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的 Syt家族中最簡(jiǎn)單的一個(gè),僅有 4個(gè)外顯子編碼,C2A保守的 Asp殘基 D3為 Ser所取代,該變異改變了 SytⅣ中 C2A結(jié)構(gòu)域和 Ca2+結(jié)合的性質(zhì),因而,可能只能結(jié)合一個(gè)或兩個(gè) Ca2+。究其生理學(xué)功能,Ferguson等認(rèn)為 SytⅣ在 CA1區(qū),是海馬依賴(lài)性記憶形成相關(guān)的短時(shí)程突觸可塑性的突觸前負(fù)調(diào)節(jié)蛋白[10];Ferguson等運(yùn)用基因突變小鼠證實(shí) SytⅣ與精細(xì)運(yùn)動(dòng)以及海馬依賴(lài)的記憶有關(guān),而且干擾 SytⅣ的水平可導(dǎo)致小鼠的記憶功能喪失[11]。Liu等發(fā)現(xiàn)BALB/c小鼠 Syt蛋白的表達(dá)水平與被動(dòng)回避測(cè)試成績(jī)正相關(guān)[12];Zhang等發(fā)現(xiàn) SytⅣ定位于星形膠質(zhì)細(xì)胞的突起,通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的谷氨酸釋放促成海馬為基礎(chǔ)的記憶[13]。可見(jiàn),SytⅣ是涉及神經(jīng)遞質(zhì)釋放過(guò)程和腦的學(xué)習(xí)記憶等生理功能的關(guān)鍵蛋白之一[14]。

有關(guān) SytⅣ年齡效應(yīng)的探討,Südhof報(bào)道 SytⅣ在出生后發(fā)育早期的水平最高,以后逐漸降低[15],并認(rèn)為與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)老年SAMP8鼠(13月齡)在背海馬 CA1、CA3和 DG中SytⅣ的相對(duì)含量顯著低于 4.5月齡青年鼠和 9月齡中年小鼠。這與 Südhof報(bào)道相一致,也與我們之前發(fā)現(xiàn)的老年昆明小鼠背海馬 CA1、CA 3和 DG中SytⅣ的相對(duì)含量顯著低于青年鼠相似。究其原因,我們推測(cè)老年小鼠背海馬中 SytⅣ的相對(duì)含量降低可能與 Syt家族代謝紊亂有關(guān),可能是 SytⅠ或其他亞型表達(dá)增加的代償。

總之,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示 SAMP8鼠背海馬 DG、CA1和CA3區(qū) SytⅣ的相對(duì)含量出現(xiàn)年齡相關(guān)性顯著降低。SytⅣ在小鼠背海馬分布部位不隨年齡增加而改變,分布部位相對(duì)穩(wěn)定。SytⅣ在海馬 DG、CA1和 CA3區(qū)的錐體細(xì)胞和顆粒細(xì)胞神經(jīng)元的胞 -樹(shù)突觸和胞 -軸突觸內(nèi)有較高分布,SytⅣ可能是樹(shù) -體式突觸和軸 -體式突觸內(nèi)主要的突觸囊泡蛋白。

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