高效液相色譜法測(cè)定活血降酶散中的丹參酮ⅡA

劉光斌李懷彪毛和平

（1甘肅省酒鋼醫(yī)院，甘肅 嘉峪關(guān) 735100；2嘉峪關(guān)市藥品檢驗(yàn)所）

高效液相色譜法測(cè)定活血降酶散中的丹參酮ⅡA

劉光斌1李懷彪2毛和平1

（1甘肅省酒鋼醫(yī)院，甘肅 嘉峪關(guān) 735100；2嘉峪關(guān)市藥品檢驗(yàn)所）

【摘要】目的：采用高效液相色譜法測(cè)定組方中主藥丹參所含藥理活性成分丹參酮ⅡA的含量。方法：色譜柱：C18（DaisoSp-120-5-ODS-AP 4.6×250 mm 5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（80∶20）；檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm，柱溫：30℃；流速：1.0 mL/min。結(jié)果：丹參酮ⅡA進(jìn)樣量在0.026 67～0.213 4 μg范圍內(nèi)線性良好（r=0.999 9），平均回收率為98.94%，RSD為1.27%。結(jié)論：所用方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、易行，可用于活血降酶散的質(zhì)量控制。

【關(guān)鍵詞】活血降酶散；高效液相色譜法；丹參酮ⅡA

活血降酶散是由丹參、五味子、紅花等中藥組成的臨床經(jīng)驗(yàn)方，經(jīng)過(guò)多年臨床療效觀察，對(duì)肝炎（包括甲肝、乙肝、丙肝）和黃疸型肝炎瘀血引起的血清轉(zhuǎn)氨酶升高者有非常顯著的降酶作用；同時(shí)能保護(hù)肝細(xì)胞損傷，促進(jìn)肝細(xì)胞再生。為確保該制劑的療效及有效控制制劑質(zhì)量，我們采用高效液相色譜法（HPLC）對(duì)組方中主藥丹參所含藥理活性成分丹參酮ⅡA（C19H18O3）的含量進(jìn)行了測(cè)定，報(bào)告如下。

1 試驗(yàn)儀器與材料

儀器：BisepTM-1100型高效液相色譜（美國(guó)通微公司）；LC-10AD高效液相色譜儀（日本島津公司）；U-3900H紫外—可見分光光度計(jì)（HITACHI日立公司）；HS2060A超聲波清洗器。

試劑：含量測(cè)定用甲醇為色譜純，水為去離子水，其他試劑均為分析純。

樣品：活血降酶散3個(gè)批次（20090705，20090820，2009 0910）均由酒鋼醫(yī)院提供；丹參酮ⅡA對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110766-200314，供含量測(cè)定用）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；色譜柱：C18（DaisoSp-120-5-ODS-AP 4.6×250 mm 5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（80∶20）；檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm，柱溫：30℃；流速：1.0 mL/min。理論塔板數(shù)按丹參酮ⅡA（C19H18O3）峰計(jì)算不低于2 000，分離度大于1.5。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取丹參酮ⅡA照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含10.668 μg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取同一批次（20090820）樣品粉末0.9 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率200 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性對(duì)照試驗(yàn)

按處方取除丹參外的各味藥材混合粉末0.6 g,按供試品溶液的制備方法，同法制得陰性供試品溶液。依法測(cè)定。結(jié)果陰性供試品在與丹參酮ⅡA對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間處無(wú)干擾，結(jié)果見圖1。

2.5 線性關(guān)系的考察

取丹參酮對(duì)照品溶液（每1mL含10.668 μg），分別精密吸取2.5、5、10、15、20 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，以對(duì)照品進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積均值為縱坐標(biāo)，求得回歸方程：Y=6×106X－1 432.4，r=0.999 9。結(jié)果表明丹參酮ⅡA對(duì)照品在0.026 67～0.213 4 μg范圍內(nèi)線性良好。

2.6 進(jìn)樣精密度試驗(yàn)

精密吸取丹參酮ⅡA對(duì)照品5 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定丹參酮ⅡA峰面積，結(jié)果RSD為0.72%，符合文獻(xiàn)[3]低于1.5%的要求。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批次（20090820）樣品粉末6份,每份0.9 g，精密稱定，按供試品溶液的制備方法制備,依法測(cè)定,結(jié)果供試品中丹參酮ⅡA平均含量為0.31 mg/g，RSD為0.32%。表明本方法重復(fù)性較好。

圖1 HPLC色譜圖

2.8 回收率試驗(yàn)

取同一批次（20090820）樣品粉末6份，每份0.90 g，精密稱定，分別精密加入丹參酮ⅡA對(duì)照品溶液（10.668 μg/ml）25 mL，按供試品溶液的制備方法制備，測(cè)定，結(jié)果平均回收率為98.94%，RSD為1.27%。結(jié)果見表1。

結(jié)果表明，本方法測(cè)定回收率較好。

表1 回收率試驗(yàn)

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液,分別在0、2、4、6、8、10小時(shí)進(jìn)樣，測(cè)得峰面積值的RSD為0.59%，結(jié)果見表2。

結(jié)果表明供試品溶液在10小時(shí)內(nèi)基本穩(wěn)定。

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.10 樣品測(cè)定

按上述方法測(cè)定三批樣品，，三批樣品丹參酮ⅡA含量平均值0.304 3 mg/g。結(jié)果見表3。

表3 樣品測(cè)定

2.11 含量限度的制定

按照表6三批樣品測(cè)定結(jié)果的平均值0.304 3 mg/g，下浮至80%計(jì)算，暫定本品每1 g含丹參按丹參酮ⅡA （C19H18O3）計(jì)算，不得少于0.24 mg。

3 討論

3.1 波長(zhǎng)的選擇

通過(guò)對(duì)丹參酮ⅡA對(duì)照品溶液在200～400 nm處進(jìn)行紫外光譜掃描檢測(cè)顯示，丹參酮ⅡA在270 nm處有最大吸收，與文獻(xiàn)[2]采用的波長(zhǎng)相同。

3.2 提取方法的確定與考察

3.2.1 提取方式的確定 取同一批次（20090820）供試品粉末0.9 g，精密稱定，置具塞三角瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定重量，分別超聲處理（功率200 W，頻率40 kHz）及與加熱回流30 min，放冷，依法測(cè)定。結(jié)果顯示，采用超聲處理與加熱回流含量結(jié)果基本一致，故采用超聲處理方式提取，以簡(jiǎn)化操作。結(jié)果見表4。

表4 提取方式的考察

3.2.2 提取溶劑的比較取同一批次（20090820）供試品粉末0.9g，精密稱定，置具塞三角瓶中，分別精密加入甲醇與乙醇各25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率200 W，頻率40 kHz）30分鐘，依法測(cè)定。結(jié)果顯示，采用甲醇提取測(cè)定含量略高，故采用甲醇作提取溶劑為宜。結(jié)果見表5。

表5 提取溶劑的比較

3.2.3 提取溶劑量的考察取同一批次（20090820）供試品粉末0.9 g，精密稱定，置具塞三角瓶中，分別精密加入甲醇25 mL、50 mL、75 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率200 W，頻率40 kHz）30分鐘，依法測(cè)定。結(jié)果顯示，提取溶劑量為25 mL時(shí)測(cè)得含量較高，故將提取溶劑量定為25 mL。結(jié)果見表6。

3.2.4 提取時(shí)間的考察取同一批次（20090820）供試品粉末0.9 g，精密稱定，置具塞三角瓶中，各精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定重量，分別超聲處理（功率200W，頻率40 kHz）15 min、30 min、45 min，依法測(cè)定。結(jié)果顯示，超聲提取30 min時(shí)供試品中丹參酮ⅡA含量較高，故將提取時(shí)間定為30 min。結(jié)果見表7。

表6 提取溶劑量的考察

3.3 耐用性試驗(yàn)

3.3.1 不同色譜柱的考察分別用DaisoSp-120-5-ODS-AP C18（4.6×250 mm，5 μm）與 AT.LICHROM C18（4.6×150 mm，5 μm）色譜柱，采用BisepTM-1100型高效液相色譜儀，測(cè)定同一批次（20090820）供試品中丹參酮ⅡA含量，二者RSD為0.58%。結(jié)果顯示，不同色譜柱對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)影響。結(jié)果見表8。

表7 提取時(shí)間的考察

3.3.2 不同儀器的考察采用DaisoSp-120-5-ODS-AP C18（4.6×250 mm，5 μm）色譜柱，分別在BisepTM-1100型與LC-10AD型高效液相色譜儀上，測(cè)定同一批次（20090820）供試品的含量，二者RSD為0.7%。結(jié)果顯示，不同儀器對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)影響。結(jié)果見表9。

表8 不同色譜柱對(duì)含量測(cè)定的影響

表9 不同儀器對(duì)含量測(cè)定的影響

參考文獻(xiàn)：

[1]周福成.2010年版《中國(guó)藥典》編制工作報(bào)告[J].中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)，2010,9（1）：9.

[2]國(guó)家藥典委員會(huì)《.中國(guó)藥典》2005年版,一部[S].2005：58，附錄6,附錄18,附錄31，附錄33,附錄114.

[3]中國(guó)藥品生物制品檢定所.中國(guó)藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范2005年版[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2005：84.

作者簡(jiǎn)介：劉光斌，男，副主任藥師。研究方向：制劑研究。E-mail：jgyylgb@sina.com

Determination of TanshinoneⅡA in Huoxuejiangmei Powder by HPLC

Liu Guangbin1,Li Huaibiao2,Mao Hepin1（1 Jiugang Hospital of Gansu，Jiayuguan 735100,China；2 Jiayuguan Institute for Drug Control）

ABSTRACTObjective:To develop a HPLC method to determine the contents of TanshinoneⅡA in Radix et RhizomaSalviaeMiltiorrhizaein HuoxuejiangmeiPowder.Methods:Thedetermination wasperformed ona DaisoSp-120-5-ODS-AP（4.6×250 mm 5 μm）.The column temperature was set at 30℃.The mobile phase consisted of methanol-water(80∶20).The UV detection wavelength was 270 nm and the flow rate was 1.0 mL/min.Results:The linear range of TanshinoneⅡA was within 0.026 67～0.213 4 μg with a correlation coefficient of 0.999 9.The average recovery was 98.94%andRSDwas 1.27%.Conclusion:The method is accurate,simple,feasible,and can be used effectively for the quality control of Huoxuejiangmei Powder．

KEY WORDSHuoxuejiangmei Powder;HPLC;TanshinoneⅡA