轉(zhuǎn)基因大豆不同加工過(guò)程DNA降解研究

葉可萍，周光宏,*，徐幸蓮，祝長(zhǎng)青,2

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 教育部肉品加工與質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095；2.江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇 南京 210001)

轉(zhuǎn)基因大豆是目前種植面積最廣、產(chǎn)量最大的商品化種植轉(zhuǎn)基因作物。從1996年至2004年世界轉(zhuǎn)基因大豆種植面積從50萬(wàn)hm2增至4840萬(wàn)hm2[1-8]，至2008年世界轉(zhuǎn)基因大豆種植面積達(dá)6580萬(wàn)hm2，占所有轉(zhuǎn)基因作物面積的53%[9]。

第一個(gè)大面積生產(chǎn)應(yīng)用的轉(zhuǎn)基因大豆是抗除草劑草甘膦大豆(round-up ready soybean，RR大豆)，由美國(guó)Monsanto(孟山都)公司1994年推出，并于1996年獲準(zhǔn)推廣，成為最早獲準(zhǔn)推廣的轉(zhuǎn)基因大豆品種[10]。其應(yīng)用Ti質(zhì)粒介導(dǎo)轉(zhuǎn)移DNA(TV-DNA)轉(zhuǎn)移技術(shù)，將矮牽牛Ti質(zhì)粒的CaMV 35S啟動(dòng)子控制EPSPS基因?qū)氪蠖?，進(jìn)而培育成的具有抗除草劑草甘膦特性的轉(zhuǎn)基因大豆品種[11-12]。

我國(guó)是世界上最大的轉(zhuǎn)基因大豆進(jìn)口和消費(fèi)大國(guó)，同時(shí)也是世界四大大豆主產(chǎn)國(guó)中唯一沒(méi)有批準(zhǔn)商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因大豆的國(guó)家。從國(guó)內(nèi)大豆產(chǎn)量來(lái)看，2000年達(dá)到1530萬(wàn)t，2005年達(dá)到1780萬(wàn)t，2007年達(dá)到1550萬(wàn)t，2008年為1750萬(wàn)t，2008年比2000年增長(zhǎng)14.3%，平均年遞增1.9%。從國(guó)內(nèi)大豆進(jìn)口量來(lái)看，據(jù)海關(guān)統(tǒng)計(jì)，2000年約1024萬(wàn)t，2005年約2659萬(wàn)t，2007年為3082萬(wàn)t，2008年達(dá)3700萬(wàn)t，2008年比2000年增長(zhǎng)261%[13]。從這些數(shù)據(jù)可看出，越來(lái)越多轉(zhuǎn)基因大豆進(jìn)入我國(guó)市場(chǎng)，其加工品已廣泛地進(jìn)入我國(guó)食物鏈。

1 轉(zhuǎn)基因大豆及其加工品的食用安全性

至今尚未發(fā)現(xiàn)食用轉(zhuǎn)基因大豆及加工品對(duì)人類健康有害的實(shí)例[14]，但各領(lǐng)域?qū)ζ浒踩缘臓?zhēng)論從未平息。Barabara[15]發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因大豆含有一種類似雌性激素的化學(xué)物質(zhì)，人類食用后會(huì)對(duì)人體荷爾蒙有一定影響，導(dǎo)致生殖器官異常，免疫系統(tǒng)發(fā)生障礙。Hardell等[16]認(rèn)為如果轉(zhuǎn)基因大豆抗生素標(biāo)記基因進(jìn)入人體，可能轉(zhuǎn)移到有害致病菌中，使它們產(chǎn)生耐抗生素的能力，從而降低抗生素的臨床有效性，也可能使人體對(duì)很多抗生素產(chǎn)生抗性。菲律賓的兒童食品中含有轉(zhuǎn)基因大豆成分，部分嬰兒對(duì)其中一些新蛋白質(zhì)產(chǎn)生了不良反應(yīng)。2002年7月英國(guó)食品標(biāo)準(zhǔn)局委托紐卡斯?fàn)柎髮W(xué)研究顯示，人類食用轉(zhuǎn)基因大豆制成的漢堡包和奶制品后，其腸道細(xì)菌內(nèi)仍帶有經(jīng)改造的基因[17]?！都~約時(shí)報(bào)》2001年8月17日?qǐng)?bào)道，比利時(shí)科學(xué)家在RR轉(zhuǎn)基因大豆中發(fā)現(xiàn)一些來(lái)歷不明的未知DNA，其只出現(xiàn)在RR轉(zhuǎn)基因大豆中，位于人工插入的基因[10]。2004年意大利烏爾比諾大學(xué)學(xué)者實(shí)驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)基因大豆可改變小白鼠肝臟結(jié)構(gòu)。葉增民等[18]認(rèn)為我國(guó)進(jìn)口轉(zhuǎn)基因大豆及加工品可能會(huì)在30年甚至更長(zhǎng)時(shí)間后對(duì)人類健康等方面產(chǎn)生影響。

2 轉(zhuǎn)基因大豆的優(yōu)勢(shì)及國(guó)內(nèi)加工趨向

與國(guó)產(chǎn)大豆相比，進(jìn)口轉(zhuǎn)基因大豆存在較大競(jìng)爭(zhēng)力，對(duì)我國(guó)傳統(tǒng)大豆形成了巨大的沖擊。我國(guó)傳統(tǒng)大豆的競(jìng)爭(zhēng)力相對(duì)較弱，主要表現(xiàn)在[19-20]：1)生產(chǎn)成本較大。轉(zhuǎn)基因大豆生產(chǎn)成本比傳統(tǒng)大豆低30%～35%，而產(chǎn)量卻高出15%～20%；2)流通費(fèi)用過(guò)高。我國(guó)大豆生產(chǎn)主要集中在東北三省，而大豆需求主要在東南沿海地區(qū)，如大型榨油廠一般都集中在我國(guó)南方沿海地區(qū)；3)品質(zhì)較差。我國(guó)大豆出油率低，進(jìn)口轉(zhuǎn)基因大豆的出油率在19%～20%，我國(guó)大豆出油率在16%～17%。同時(shí)我國(guó)大豆品質(zhì)的另一缺陷是專用性不強(qiáng)，目前我國(guó)培育的大豆品種是蛋白質(zhì)和高出油率混用品種，而國(guó)外培育的多是高蛋白質(zhì)或高含油率的專用品種。

轉(zhuǎn)基因大豆大部分用于榨油，據(jù)估計(jì)我國(guó)80%～90%的大豆油是用轉(zhuǎn)基因大豆加工而成[18]。主要原因包括：1)安全性。油中轉(zhuǎn)基因成分微量，基因主要存在于大豆蛋白中，包括轉(zhuǎn)基因大豆普遍種植的美國(guó)也很少使用轉(zhuǎn)基因大豆直接加工成食品和大豆蛋白。我國(guó)2007年進(jìn)口大豆3082萬(wàn)t，100%用于榨油[13]；2)利潤(rùn)。由于轉(zhuǎn)基因大豆價(jià)格低廉、出油率高，利潤(rùn)較高，對(duì)于油脂企業(yè)來(lái)說(shuō)具有很大的誘惑；3)可利用性。轉(zhuǎn)基因大豆不僅可以作為油料資源，同時(shí)制油后的餅粕又是發(fā)展我國(guó)飼養(yǎng)業(yè)的優(yōu)質(zhì)蛋白資源。

進(jìn)口大豆幾乎全部是轉(zhuǎn)基因大豆，從食品安全考慮適宜用于榨制豆油，而國(guó)產(chǎn)大豆的主要用途不再是榨油，而是直接用于食品加工領(lǐng)域。可見(jiàn)國(guó)產(chǎn)大豆與進(jìn)口大豆在加工用途上已經(jīng)明顯分化。

3 不同加工過(guò)程對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆內(nèi)、外源DNA降解的影響

原料經(jīng)過(guò)若干道加工工序(如熱、壓力、酸堿和酶解等物理、化學(xué)或生物處理)，理化性質(zhì)發(fā)生變化，使DNA產(chǎn)生一定的降解[21]。英國(guó)利茲(Leeds)大學(xué)研究表明，加工工藝可使某些轉(zhuǎn)入的外源DNA斷裂，當(dāng)外源DNA片段小于單個(gè)基因大小時(shí)，物質(zhì)就不可能通過(guò)其遺傳而生存。因此，轉(zhuǎn)基因食物經(jīng)加工、烹調(diào)后，DNA的完整性、維持的時(shí)間及生物學(xué)活性值得關(guān)注。一個(gè)功能性的基因要想從轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)移到細(xì)菌中需要達(dá)到250bp以上[22]。因此，不僅要關(guān)心產(chǎn)品及副產(chǎn)品中是否含有轉(zhuǎn)基因成分，而且也必須知道外源基因片段在加工過(guò)程中長(zhǎng)度的變化規(guī)律。

3.1 轉(zhuǎn)基因大豆加工品

近幾年來(lái)國(guó)內(nèi)外一些學(xué)者開(kāi)始研究不同加工環(huán)節(jié)內(nèi)外源基因的變化規(guī)律。對(duì)于一些傳統(tǒng)的豆制品，如豆腐、豆粉、豆奶等，主要是研究磨漿、煮漿等簡(jiǎn)單的物理、化學(xué)加工過(guò)程。Bauer等[23]研究發(fā)現(xiàn)在豆奶和豆腐中可檢測(cè)到1339bp片段。對(duì)于轉(zhuǎn)基因大豆制成的豆奶和豆腐，生豆奶煮沸10min，基因片段從1714bp降到1339bp，而在豆腐中并未發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步的DNA降解。陳穎等[24]研究發(fā)現(xiàn)豆腐、豆奶、豆粉不同加工工藝對(duì)DNA的降解影響不同，終產(chǎn)品的DNA片段大小也不盡相同。物理過(guò)程如磨漿等能使大豆凝集素(Lectin)基因長(zhǎng)度降解至原來(lái)的一半(約1000bp左右)；高溫煮漿處理DNA片段并未受到破壞，但更高溫度及更長(zhǎng)時(shí)間的殺菌使豆奶及豆粉中Lectin片段大小僅為400bp以下；蛋白質(zhì)變性過(guò)程同時(shí)也是DNA降解加劇的過(guò)程，豆腐的蛋白質(zhì)變性使Lectin片段從800bp降至200～400bp左右，這與Bauer結(jié)論有所不同。梁杉等[25]用高壓蒸氣處理豆粕，研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)啟動(dòng)子基因和終止子基因的影響明顯不同，啟動(dòng)子基因均可檢測(cè)到246、165bp和101bp這3個(gè)處理后的片段，而終止子基因只能檢測(cè)到125bp片段，217bp片段在處理后檢測(cè)不到，這與陳穎等[26]報(bào)道相反。Peano等[27]研究了豆粉、薄脆餅干和豆腐中內(nèi)源大豆Lectin的降解情況，在豆粉中能夠檢測(cè)出1626bp的該基因片段，薄脆餅干和豆腐中只能分別檢測(cè)出391bp和169bp。梁克紅[28]研究豆粕進(jìn)行干熱、濕熱、膨化處理后外源基因片段的降解情況。外源基因片段隨溫度的升高、加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，降解更嚴(yán)重，經(jīng)過(guò)120℃干熱10min后，降解到408bp以下；高壓對(duì)外源基因片段造成了嚴(yán)重的破壞，濕熱1min，外源基因降解到807bp以下；膨化處理對(duì)外源基因的影響不大，膨化以后外源基因降解到1512bp以下。Debode等[29]將轉(zhuǎn)基因大豆粉分別進(jìn)行微波、加熱、超聲波破碎、高壓蒸汽處理，熒光定量PCR定量檢測(cè)內(nèi)源及外源成分發(fā)現(xiàn)，物理處理導(dǎo)致Ct值(每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))的增加，即DNA含量減少。但最終的ΔCt值并沒(méi)有改變，即物理處理不會(huì)減少轉(zhuǎn)基因成分的相對(duì)含量，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)物理處理很難使DNA降解到100bp以下。Murray等[30]也利用Real-time PCR定量檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室模擬豆腐加工過(guò)程中DNA的降解變化，對(duì)各加工工序點(diǎn)內(nèi)外源基因成分進(jìn)行絕對(duì)定量。Yoshimura等[31-32]根據(jù)其實(shí)驗(yàn)加工過(guò)程，設(shè)計(jì)不同引物擴(kuò)增比較研究發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)增RRS結(jié)構(gòu)特異性基因101bp片段和121bp片段，與擴(kuò)增的內(nèi)源基因Lectin長(zhǎng)度(118bp)相似，最適合定量檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆加工品。

對(duì)于大豆蛋白、大豆油、醬油等大豆的深加工品，DNA降解程度較大，DNA最終降解到什么程度需更深入的認(rèn)識(shí)，這對(duì)DNA高效提取及檢測(cè)技術(shù)靈敏度提出了更高的要求。Bauer等[23]研究大豆深加工蛋白質(zhì)D N A降解情況，發(fā)現(xiàn)其能擴(kuò)增到7 1 4 b p片段。Vijayakumar等[33]模擬加工過(guò)程，通過(guò)加熱、高壓滅菌、微波等加工環(huán)節(jié)轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)，DNA的完整性、回收率和PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度(＜200bp)是影響轉(zhuǎn)基因成分定量檢測(cè)的主要因素。轉(zhuǎn)基因大豆作為原料提取大豆油已成為現(xiàn)今轉(zhuǎn)基因大豆主要用途之一。但大豆油中DNA含量較少，降解程度較大，使定性定量檢測(cè)產(chǎn)生一定困難。Grysona等[34]在實(shí)驗(yàn)室模擬了大豆油的精煉過(guò)程，并且在大豆毛油中檢測(cè)到轉(zhuǎn)基因成分。Patrizia等[35]利用基于DNA的傳統(tǒng)方法和DNA生物傳感器能監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆油加工鏈各個(gè)環(huán)節(jié)轉(zhuǎn)基因成分情況。王小花[36]對(duì)大豆毛油精練成精煉油過(guò)程中的4道重要的工序進(jìn)行采樣，用Taqman探針PCR檢測(cè)每個(gè)樣品的Lectin基因和CaMV 35S啟動(dòng)子基因，建立了可靠的DNA提取技術(shù)和大豆油中轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)方法。

轉(zhuǎn)基因大豆經(jīng)過(guò)加工后，DNA發(fā)生降解，在深加工品中外源成分基因片段長(zhǎng)度甚至小于200bp，但降解到小于100bp的可能性很小，相關(guān)監(jiān)管部門可選擇合適的片段長(zhǎng)短進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)，不同加工過(guò)程中大豆DN A降解程度差別較大，因此對(duì)于轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)，特別是定量檢測(cè)，可根據(jù)不同的加工品采用不同的方法。

3.2 含有轉(zhuǎn)基因大豆成分的加工品

國(guó)外已有轉(zhuǎn)基因大豆加工品進(jìn)入到食物鏈中。如Fabio等[37]對(duì)巴西市場(chǎng)上含大豆蛋白質(zhì)的肉制品添加劑進(jìn)行研究表明，在32個(gè)食品添加劑樣本中，25個(gè)樣本檢測(cè)到Lectin基因164bp片段，15個(gè)樣本中檢測(cè)到抗草甘膦大豆的特異基因169bp片段；在8種肉制品中檢測(cè)到Lectin基因，3種檢測(cè)到抗草甘膦大豆特異基因。Taski-Ajdukovic等[38]在塞爾維亞市場(chǎng)上銷售的51種肉制品中，發(fā)現(xiàn)其中12種可檢測(cè)到35S啟動(dòng)子的195bp片段，并利用Real-time PCR對(duì)陽(yáng)性品進(jìn)行定量檢測(cè)。Cardarelli等[39]在檢測(cè)市場(chǎng)大豆產(chǎn)品及可能含有大豆成分的加工品中，6種香腸產(chǎn)品中2種存在RR大豆DNA成分。Greiner等[40]抽查的100個(gè)樣品中21%含有轉(zhuǎn)基因成分，其中3種大豆分離蛋白中就有一種檢測(cè)出含外源基因。Ujhelyi等[41]調(diào)查匈牙利市場(chǎng)21種肉制品，均檢測(cè)到Lectin基因，同時(shí)定量檢測(cè)外源基因發(fā)現(xiàn)其中5種樣品轉(zhuǎn)基因成分含量大于5%，3種樣品轉(zhuǎn)基因成分含量在0.9%～5%之間，4種樣品轉(zhuǎn)基因成分含量小于0.1%。RR大豆的大豆蛋白已作為食品成分在加工肉制品中商業(yè)化應(yīng)用，對(duì)肉制品的安全性提出了新的挑戰(zhàn)。因此有必要摸清轉(zhuǎn)基因大豆加工品中外源成分的情況，為其進(jìn)入下游食物鏈的溯源追蹤做好準(zhǔn)備。

在轉(zhuǎn)基因大豆及其加工品進(jìn)入食品市場(chǎng)后，許多國(guó)家已開(kāi)始對(duì)轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行標(biāo)識(shí)和追溯。但轉(zhuǎn)基因大豆在加工過(guò)程中DNA會(huì)發(fā)生不同程度的降解，這對(duì)轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)提出更高的要求。因此，了解大豆加工品中DNA的降解程度及其外源成分含量，以及不同加工工藝對(duì)DNA降解程度的影響，對(duì)轉(zhuǎn)基因加工品的檢測(cè)有重要的作用，能提供轉(zhuǎn)基因作物在我國(guó)食物鏈中加工及流通環(huán)節(jié)的相關(guān)信息，對(duì)于轉(zhuǎn)基因食品安全的檢測(cè)監(jiān)控及其追溯均有十分重要的意義。

4 展 望

轉(zhuǎn)基因大豆已進(jìn)入食物鏈，其安全性越來(lái)越受到關(guān)注，不僅要考慮大豆及其加工品的轉(zhuǎn)基因成分，還要考慮其在加工過(guò)程中的變化以及基因組DNA降解后造成的影響，開(kāi)展主要加工工藝對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆DNA片段大小及含量的影響研究，全面研究轉(zhuǎn)基因大豆不同加工過(guò)程內(nèi)外源基因的變化情況。

在加工過(guò)程中，轉(zhuǎn)基因大豆不同DNA片段降解程度不同，不同加工過(guò)程中轉(zhuǎn)基因大豆DNA降解程度也不同，國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究結(jié)果對(duì)此存在爭(zhēng)議，仍有必要進(jìn)一步深入研究，這對(duì)于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品定性定量檢測(cè)時(shí)根據(jù)不同加工品DNA片段的降解程度，設(shè)計(jì)大小適合的擴(kuò)增引物具有非常重要的意義。

隨著國(guó)產(chǎn)大豆的緊缺，轉(zhuǎn)基因大豆占據(jù)我國(guó)市場(chǎng)，國(guó)內(nèi)火腿腸生產(chǎn)企業(yè)不得不從美國(guó)、日本進(jìn)口大豆及大豆粉，由于美國(guó)大豆主要是轉(zhuǎn)基因大豆，轉(zhuǎn)基因大豆很有可能進(jìn)入到下游食物鏈中，食品受轉(zhuǎn)基因成分污染的可能性很大。因此，深入研究轉(zhuǎn)基因大豆加工過(guò)程DNA降解變化，確定轉(zhuǎn)基因大豆加工品中轉(zhuǎn)基因成分的含量及降解程度，根據(jù)加工過(guò)程每一個(gè)加工環(huán)節(jié)DNA情況，滿足食品加工鏈中溯源需要，并作為進(jìn)行轉(zhuǎn)基因食品標(biāo)識(shí)與追溯環(huán)節(jié)監(jiān)控的基礎(chǔ)工作。同時(shí)轉(zhuǎn)基因大豆加工品加工過(guò)程DNA降解情況的分析，為其進(jìn)入食物鏈下游產(chǎn)品(如西式肉制品等)打好基礎(chǔ)，提供轉(zhuǎn)基因大豆成分在我國(guó)食品鏈中加工及流通環(huán)節(jié)的信息，為轉(zhuǎn)基因成分的標(biāo)識(shí)與追溯提供依據(jù)，確保“從農(nóng)田到餐桌”全程將轉(zhuǎn)基因大豆與非轉(zhuǎn)基因大豆加工品分開(kāi)和標(biāo)識(shí)。

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